血液病是原发于造血系统的疾病, 或影响造血系统伴发血液异常改变,其常表现为贫血、出血和发热等症状。我国儿童恶性癌症的发病率呈上升趋势,截至2014 年的数据显示,儿童恶性肿瘤中,白血病的发病率居第一位,约占1/3。对于恶性血液系统疾病而言,临床上的化疗效果往往不甚理想。自从20 世纪中期,Thomas 教授首先开展了造血干细胞移植以来,造血干细胞移植广泛地被应用于血液病的临床治疗中,已经成为治疗急性白血病、恶性淋巴瘤、重型再障等病的有效手段之一。目前造血干细胞的主要来源是脐带血、骨髓和外周血[1]。造血干细胞移植主要分为自体和异体造血干细胞移植两种。尽管自体移植具有无移植排斥、移植物抗宿主病等并发症的优点,但自体HSC 中残留存在的肿瘤细胞可能导致移植后疾病复发;相反异体移植虽然远期疗效优于自体移植且复发率低,但是配型效率极低,来源有限,从而限制了异基因HSC 移植的临床应用。
因此,目前迫切寻求更为安全、成本较低、来源稳定简单的造血干细胞资源。而对胚胎干细胞和iPS 细胞定向分化为造血干细胞技术的研究有望解决这一难题。研究表明,小鼠、猴子和人的ESCs 在体外都可以被诱导造血分化[2, 3, 4]。由于胚胎干细胞及其衍生物存在取材困难、免疫排斥、伦理道德等问题,而iPS 细胞不存在上述问题,因此其成为很好的研究对象并有望应用于临床。iPS 细胞被称为多能性细胞[5],在体外能被诱导分化成多种来自各个胚层的细胞,如造血细胞,神经前体细胞,心肌细胞和生殖细胞衍生的细胞[6, 7]等。iPS 细胞这一特性将可能为揭示造血干细胞的发生过程提供一个较好的研究平台,同时可帮助深入了解各类血液病的发病机制并为其治疗带来曙光。
1 iPS 体外分化为造血干细胞研究进展
目前,科学家们研究胚胎干细胞体外定向分化成造血干/ 祖细胞已取得了骄人的成绩。在1985 年,Doetshman 首先报道了小鼠胚胎干细胞可以在体外诱导生成造血细胞[8]。2001 年,Kaufman 等[9]实验室首次发现,人类的胚胎干细胞可分化为造血细胞的各个系。2006 年,Yamanaka 和Takahashi[10]将4种因子导入小鼠成纤维细胞,成功地诱导出iPS细胞。次年,美国Thomson 实验室将人类成纤维细胞诱导生成iPS 细胞[11]。iPS 细胞在体外能像ESCs 一样诱导分化为多种细胞,而且因为来源于自身组织或细胞而不涉及伦理问题和免疫排斥等问题。iPS 细胞的诞生进一步缩小了干细胞和临床治疗的疾病之间的距离,将可能成为再生医学最有希望的供体细胞。学者在研究ESCs 体外分化的过程中,推断iPS也应具有分化为造血干细胞的潜能,大量的实验亦证明了这一推断。在诱导过程中,人们借鉴了ESCs分化为造血干细胞的成功经验。在2009 年,Choi 和Sulkvin 等[12]成为第一个报道了iPSC 细胞与OP9基质细胞共培养诱导造血分化的研究者,研究发现分化而成的单核淋巴细胞具有造血功能。 2010 年,Lapillonne 等[13]用胚状体(embryoid body,EB)的方法将人iPSCs 诱导分化成为红细胞,同时利用人胚胎干细胞作为对照组,结果发现从h-iPSC 分化而成的红细胞与从h-ESC 来源的几乎完全一致,无论从表面抗原、血红蛋白类型或功能上都无差别。2011 年,Dias 等[14]利用OP9 基质细胞同时将h-iPSC和h-ESC 诱导分化成红细胞,其结果与之前报道的结果非常相似,并且都生成了胎儿血红蛋白。除了形成拟胚体和与基质细胞共培养这两种经典方法,Niwa 等[15]利用单层诱导的方法将人体细胞来源的iPS 细胞诱导分化得到CD34+ 细胞,他们采用无血清培养基添加VEGF、SCF、BMP4、TPO 等细胞因子得以完成分化。
最近的研究发现,不仅正常组织细胞可建立iPS 细胞系,恶性组织细胞亦可诱导生成iPS 细胞系。病人特异性iPS 细胞系的建立,在细胞替代性治疗、发病机制研究及药物筛选方面具有潜在价值。2007年,Hanna 等[16]将遭受镰状细胞贫血疾病的人源化小鼠成纤维细胞重编程为iPSCs。2009 年,Raya 等[17]将Fanconi 贫血病人的体细胞重编程以获得患者来源的iPS 细胞,随后他们将该细胞进行了基因纠正。实验证实了校正后的细胞分化为红系和髓系造血干细胞的能力与正常的相似。 2010 年,Carette 等[18]建立了恶性细胞来源的iPS 细胞系,他本次应用的细胞为慢性粒细胞白血病患者的体细胞。 2013 年,Saliba 等[19]利用CD34+ 细胞在体外诱导生成iPS 细胞,而该CD34+ 细胞来源于骨髓增值性肿瘤患者。2015 年,本课题组Song 等[20]利用β-地中海贫血患者的血液中分离的外周血单核淋巴细胞诱导生成iPS细胞系并利用CRISPR/Cas9 打靶修复相关致病基因,结果表明,打靶修复后的iPS 细胞造血分化效率明显改善且可以生成β-珠蛋白(HBB)。
2 体外诱导生成的造血干细胞的动物移植研究进展目前对造血干细胞的功能鉴定主要有集落形成(CFU-C) 实验、LTC-IC(long-term culture-initiatingcell)实验以及造血系统重建实验。然而对造血干细胞功能鉴定最严格的标准是重建造血能力的移植实验。由于目前最大的瓶颈问题是无法获得大量且有功能的造血干细胞。因为体外实验很难反映一个细胞群体中体内长期再植造血干细胞的真实数目和活性,这也致使体外检测良好的细胞亚群,移植后不能长期重建造血和免疫的问题。为了攻破这一瓶颈问题,各种动物模型逐步开始建立。1983年,Bosma 等首次建立了人源性小鼠动物模型,最开始该免疫缺陷鼠只是缺乏B、T 细胞[21]。1995年,Shultz 等[22] 建立了NOD/SCID 小鼠,这一模型的建立支持了更高水平的移植实验。随后一段时间,Shultz 课题组又开发了NOR,BALB/c 等模型鼠。NSG 鼠除了缺乏B、T 细胞,它将NK 细胞也清除,研究表明,NSG 小鼠进行CD34+ 体内移植效率比NOD/SCID 小鼠高5 倍多[23]。2011 年,Rongvaux课题组发现在小鼠中表达一些人类因子,如TPO、IL-3、GM-CSF 等可以提升移植效率[24]。有趣的是,性别也可以影响移植效果,Notta 课题组发现雌性的NSG 小鼠比雄性小鼠移植效率高6 倍多[25]。
HSC 不具有特异性的形态学特征,而且数量极少、体积较小、比重很轻。这些都增加了对其识别的难度,因为用于移植的细胞只有百万分之一是有效细胞,那么如何将iPSCs 体外分化而来的造血干细胞“纯化”得到了广泛的关注。目前最常用的分离办法就是利用HSC 表面的标志蛋白对其进行分离。CD34 分子表达于早期造血干/ 祖细胞,内皮细胞和胚胎成纤维细胞表面,占血细胞总数量低于5%,人们最早分离造血干细胞就是应用CD34,而随着研究的继续深入,人们发现CD34+ 细胞可分为许多亚群,大多数细胞已被定向到特定的细胞系[26]。之后干细胞的表面标记CD90 与CD34 一起作为有多能造血干细胞的标记[27]。CD45RA、CD38 是分化后前体细胞的表面标记,Lin 认为其为特定细胞系的系列标记,如果表达阳性,则它就成为已分化的细胞。之后Notta 等[28]通过移植实验研究发现CD49f 可以作为进一步区分HSCs 的标志。CD49f 在大约50%的Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+ 的细胞中有表达,在大约25% 的Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90-细胞中有表达,移植单个Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+Rho-的细胞可以重建小鼠造血系统,这说明使用CD49f 可以更好的区分HSCs。Osawa 等[29]研究发现利用CD34+c-Kit+Sca-1+Lin- 细胞群植入致死量辐射的小鼠,结果表明该亚群的细胞表现出早期但并不持久的多系造血重建。Morel 等[30]发现将CD34+Thy1lowLin-/lowSca-1+ 细胞亚群移植入小鼠后其造血功能也可恢复。证明该群体富含中短期多系祖细胞。除了免疫缺陷鼠,Zanjani 等[31]利用胎羊动物模型来验证CD34+Lin-、CD34+Lin-CD38- 和CD34-Lin- 三种细胞亚群的体内重建能力。结果发现,在移植后达10 个月以上时存活的胎羊骨髓中仍存在人的造血细胞。这些研究都为日后iPS 细胞分化而来的造血干细胞应用于临床奠定必要的基础。
3 iPS 技术在血液系统疾病中应用前景及存在的问题理论上诱导多能干细胞可以被诱导生成人体组织和器官,且基因纠正的iPS 细胞还可以为遗传性疾病提供新的治疗方式,因此iPS 技术的再生治疗和自体组织替代疗法具有很大的发展前景,为遗传性、恶性血液疾病提供了重要的使用价值。对于常见的疾病如白血病,再生性贫血障碍,造血功能障碍等,结合iPS 技术、基因修复及移植治疗是一种崭新的治疗方法。但目前iPS 细胞真正应用于临床治疗还面临这许多障碍,如安全性问题,山中伸弥团队最初使用逆转录病毒进行多能干细胞诱导,后来科学家们相继使用慢病毒、腺病毒和质粒来代替[32],但也存在各种病毒污染的问题。而我国邓洪魁教授研究表明小分子化合物可诱导小鼠体细胞重编程为多能干细胞[33],也有利用仙台病毒等方法诱导人外周血淋巴细胞为iPS[34],这些方法很大程度上提高了体外重编程iPS 细胞的安全性;其次是诱导分化效率低,在体外集落刺激因子(colony stimulatingfactor,CSF)、白介素家族(interlukin,IL)、红细胞生成素(erythropoietin,EPO)等可诱导iPS细胞分化为造血干细胞,但诱导效率都不高,不能达到临床需要量。另外,许多研究报道不同组织来源的iPS 细胞保留了供体组织来源的组织记忆信息,而且在后续的分化过程中也体现出倾向性[35, 36]。最近,Sanchez-Freire 等[37]研究发现使用同一患者的心脏祖细胞和皮肤成纤维细胞建立的iPS 细胞系,体外定向诱导分化为心脏祖细胞的效率存在明显差异,心脏祖细胞来源的iPS 细胞分化为心脏祖细胞的效率显著高于皮肤成纤维来源的iPS 细胞。因此选用何种组织来源的细胞制备iPS 也是血液系统疾病iPS 细胞治疗必须解决的关键问题。最后就是移植的问题,虽然已有大量的动物实验证明iPS 细胞可用于治疗疾病,且这些细胞表面标记基因的研究中发现HSCs 细胞表面一些特异性的表面标记,但是通过这些标记并不能完全区分出所有的HSCs,如通过Lin-CD34+ CD38-CD45RA-CD90+CD49f+Rho-分离出的单个细胞,重建小鼠造血系统的成功率不到20%[38]。由于重建效率如此之低,所以应用于人类的治疗一直没有开展,直到2014 年9 月,Nature 杂志报道了世界首例利用患者皮肤成纤维细胞来源的iPS 细胞体外定向诱导分化为视网膜色素上皮细胞治疗老年性黄斑性病变的临床治疗实验,临床实验的效果还有待时间来进一步验证[39]。
4 展望虽然对人类和小鼠胚胎干细胞体外分化成造血干细胞的研究已经取得了较大的进展,但由于人类胚胎干细胞是从人类早期胚胎囊获得,其来源有限、涉及伦理及免疫排斥问题,在临床应用及研究中存在很大的局限性,而从体细胞诱导的iPS 细胞体外诱导分化为造血干细胞则有效地回避了这些问题,使干细胞向临床应用又迈进了一大步。与此同时,造血干细胞相关技术的不断发展完善也使得越来越多的恶性血液系统疾病逐渐被攻破。这两者相辅相成,iPS 细胞体外分化为造血干细胞的研究也已取得突破性的进展。相信不久的将来,在人类的iPS 细胞中将会衍生出更多其他类型的细胞,这为细胞治疗、药物筛选及某些特异性疾病的治疗提供了无尽的供体细胞,在再生医学领域和动物生物技术中具有广阔的应用前景。
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