链霉菌（Streptomyces） 在分类学上属于原核生物界、放线菌目、链霉菌科，是一类具有分枝丝状体的好氧革兰氏阳性细菌^[1]，是土壤中主要的微生物类群之一。链霉菌基因组平均大小为8 000kb，约为大肠杆菌基因组的两倍^[2]。同其它生物相比，其基因组最大特征之一就是其DNA 具有极高的G+C mol%，可高达69%-78%，是迄今为止已知的G+C mol% 含量最高的生物类群之一^[3]。链霉菌是工业微生物中最具有商用价值的类群之一。人们已经了解到自然界中有近70% 的抗生素是由链霉菌及其近缘放线菌产生的。自1928 年Alexander Fleming发现第一个抗生素——青霉素以来，数以万计的抗生素正源源不断地被人们发现和创造出来并造福于人类^{[4, 5, 6, 7]}。

阿扎霉素F 最早是由Arai^[8]于1959 年发现并从吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus var. 中分离得到的。1995 年，Krystofova^[9]研究组对该抗生素的钙离子通道作用进行了初步的研究。

2010 年，研究人员在海南省的沿海红树林根系土壤中分离纯化得到Streptomyces sp. 211726。经过发酵培养和产物结构鉴定，发现它可以同时产生13种结构略有差异的系列阿扎霉素，区别仅仅在于阿扎霉素C-23 位和C-25 上连接的基团不同^{[10, 11, 12, 13]}，并对所发现的这13 种化合物命名为阿扎霉素S4-S16，其中S13、S15 和S16 分别与国际上已报道的阿扎霉素F_3a、F_4a 和F_5a 结构一致^[14]。生物学活性检测表明，在这一系列化合物中以阿扎霉素F_3a 为代表的多种化合物都具有明显的抗尖孢镰刀菌（F.oxysporum）活性^{[10, 11, 12, 13]}，表明该类抗生素在抗香蕉枯萎病病原菌具有良好防治作用。这些化合物还对白色念珠菌表现出明显的拮抗作用，其抗白色念珠菌（Candidaalbicans）的有效性与氟康唑（Fluconazole）和两性霉素B 相当，就其毒性而言，阿扎霉素F 系列化合物的毒性较氟康唑大，但是小于两性霉素B^[15]。此外，毒性实验还表明在Streptomyces sp. 211726 所产生的阿扎霉素F 系列化合物中除阿扎霉素F_5a 外其余12种化合物均对人类结肠癌细胞HCT-116 表现出一定的细胞毒作用，预示着该系列化合物在人类肿瘤疾病治疗方面的潜在应用^[13]。由于致病真菌耐药性的日益严重和结构修饰研究的日益深入，因此开展以提高有效性、降低毒性为目的的结构改造研究越来越得到人们的广泛关注。但是目前关于阿扎霉素F的分子水平上的结构改造研究还尚未报道，这可能与其限制性修饰作用强，遗传操作困难有关。因此，有必要建立起阿扎霉素F 产生菌链霉菌21172 的接合转移体系，以推动其分子生物学研究。

本研究拟建立阿扎霉素F 产生菌链霉菌211726的基因转移体系，探讨通过接合转移向链霉菌211726 导入外源DNA 片段的可能性，旨在为该菌的生物合成基因改造奠定基础。

阿扎霉素F 产生菌链霉菌211726是洪葵教授赠与，基因克隆受体E.coli DH10B、接合转移供体菌E.coli ET12567（pUZ8002）、整合型质粒pSET152 和pIB139（均携带阿泊拉霉素抗性基因aac（3）Ⅳ，接合转移位点oriT）均为笔者实验室保存。

硫链丝菌素和阿泊拉霉素购自美国Sigma 公司；氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、硫链丝菌素、Lambda/Hind Ⅲ、限制性内切酶、DNA 回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自大连宝生物工程有限公司；其他常用试剂均购于上海国药集团。

链霉菌211726 的平板培养基为 SFMS，培养细菌的为LB 培养基、孢子预萌发培养基为2×YT、接合转移使用的是SFMS 培养基。

LB 中抗生素终浓度为：阿泊拉霉素25 μg/mL，氯霉素25 μg/mL，卡那霉素25 μg/mL，氨苄青霉素100 μg/mL ；接合转移培养基中抗生素终浓度为阿泊拉霉素25 μg/mL，萘啶酮酸25 μg/mL。

将已灭菌的SFMS 培养基融化，温度降至45℃，加入适当质量浓度的抗生素（卡那霉素 0-100 μg/mL ；氯霉素 0-100 μg/mL ；阿泊拉霉素 0-100 μg/mL ；硫链丝菌素 0-100 μg/mL），将链霉菌211726 菌株的孢子悬液涂布平板，28℃培养5 d，根据链霉菌211726 菌株生长状态评定链霉菌211726 菌株对抗生素的敏感性。

将整合型质粒pSET152 和pIB139 通过CaCl₂ 法导入接合转移供体菌E.coli ET12567（pUZ8002）中，借助于pUZ8002上tra 基因，上述两种质粒以接合转移方式从大肠杆菌导入到链霉菌211726 细胞中，并进行整合。接合转移方法主要依据文献^[16]进行改进。

以整合型质粒pSET152和pIB139 上的阿泊拉霉素抗性基因aac（3）Ⅳ 为模板，设计引物CP1 和CP2 以验证阳性接合转移子。CP1 ：5'-TTTATCACCACCGACTATTTGC-3' ；CP2 ：5'-TCATCTCGTTCTCCGCTCA-3'。按照文献^[9]方法提取链霉菌211726 基因组DNA 并进行PCR 验证。PCR 条件反应程序为：98℃ 1 min ；98℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 30 s，30 个循环；72℃ 延伸10 min。

将接合子接种于不含抗生素的SFMS 平板上，待其孢子成熟（约15 d）后，再次接种于不含抗生素的SFMS 平板上，连续转接3次后进行分离纯化，随机挑选单菌落，转接到含有25 μg/mL 阿泊拉霉素的SFMS 平板上，5 d 后根据单菌落能否生长来确定质粒pSET152 和pIB139 在接合子中的遗传稳定性。

为确定抗生素抗性基因能否用于链霉菌211726菌株进行遗传操作的选择标记，检测了链霉菌211 726 菌株对几种抗生素（阿泊拉霉素、氯霉素、卡那霉素、硫链丝菌素等）的抗性水平。结果（表 1）显示，链霉菌211726 菌株在含有12.5 μg /mL 卡那霉素和阿泊拉霉素的培养基上不能生长，表明链霉菌211726 菌株对卡那霉素和阿泊拉霉素非常敏感；链霉菌211726 菌株在含有25 μg /mL 氯霉素的培养基上不能生长，表明链霉菌211726 菌株对氯霉素比较敏感；链霉菌211726 菌株在含有硫链丝菌素100μg/mL 的培养基上都能生长，说明链霉菌211726 对硫链丝菌素不敏感。鉴于本研究中使用的接合转移质粒携带有阿泊拉霉素抗性基因aac（3）Ⅳ，因此以25 μg /mL 阿泊拉霉素筛选接合转移子。

表 1 链霉菌211726 在4 种不同浓度抗生素平板上的生长情况

表选项

通过两亲接合转移法分别将质粒pSET152 和pIB139 从供体菌E.coli ET12567（pUZ8002）导入到链霉菌211726 的新鲜菌丝体和孢子中，结果表明，在链霉菌211726 菌株萌发孢子作为受体菌与含有质粒pSET152 和pIB139 的大肠杆菌E.coli ET12567（pUZ8002）菌株进行两亲接合转移的实验中，能够获得阿泊拉霉素的抗性菌落；而在链霉菌211726菌株新鲜菌丝体作为受体菌与含有质粒pSET152 和pIB139 的大肠杆菌E.coli ET12567（pUZ8002）菌株进行的两亲接合转移的实验中，没有得到阿泊拉霉素的抗性菌落。

为了确定接合转移过程中受体菌和供体菌接种最佳比例，不同比例的大肠杆菌和链霉菌211726 孢子进行混合涂布平板。结果（表 2）表明，当大肠杆菌与孢子的比例达到8∶1 时，获得的接合转移子数最多。

表 2 基于链霉菌孢子的接合转移平板统计

表选项

以CP1 和CP2 为引物进行PCR 扩增验证，并以出发菌株链霉菌211726 基因组DNA 的扩增结果作为阴性对照，质粒pSET152 和pIB139 的扩增结果作为阳性对照，扩增结果（图 1）显示，所获得的2株接合转移子都可以扩增出预测的882 bp 条带。分别回收2 株接合转移子扩增条带，TA 克隆后送测序，测序结果也证实了2 株皆为阳性克隆子。

图 1 来自pIB139 和pSET152 接合转移子的PCR 验证

图选项

为了检测质粒pIB139 和pSET152 在链霉菌211726 菌株中的稳定性，随机挑取验证正确的 200个接合转移子，发现它们在添加有阿泊拉霉素和无抗生素的SFMS 培养基平板上都能生长，没有发现阿泊拉霉素抗性消失的菌落。结果表明质粒pIB139和pSET152 在链霉菌211726 菌株中可稳定存在。

将外源DNA 导入宿主细胞的方式主要有：钙转化、接合转移、电转化和显微注射等。其中，接合转移因导入效率较高、高度跨种属差异、价格低廉、操作方便等优势被广泛应用于链霉菌研究领域。

质粒是一种闭合环状双链DNA^[17]，它不属于基因组DNA，游离于染色体DNA 之外。在链霉菌遗传操作中人们常将其作为载体来介导外源DNA 向宿主细胞的导入。载体可依据其是否能整合到链霉菌染色体DNA 上的特点分为整合型载体和非整合型载体，例如，整合型质粒pIB139 和pSET152^{[18, 19]}。而非整合型载体又可依据其是否含有链霉菌复制子分为自杀型载体和游离型载体^[20]，例如游离型载体pYH7^{[21, 22]}。

在接合转移过程中，含有外源载体的供体菌（大肠杆菌）和受体菌链霉菌在同一个平板上生长时，两者之间存在不可避免的相互竞争。由于链霉菌的生长速度比大肠杆菌的生长速度缓慢，过量的大肠杆菌会使链霉菌的生长受到抑制，导致接合转移率降低。因此，在建立一个新菌株的遗传操作系统时摸索供体菌与受体菌之间的最佳比例就尤为重要。

本研究通过对链霉菌211726 抗生素敏感性测定和基于孢子和菌丝体接合转移系统的摸索，成功地将位点特异性整合型载体质粒pIB139 和pSET152 整合到链霉菌211726 染色体中，在分子水平证明所获得的接合转移子的正确性，这说明本研究建立的遗传操作系统是有效可行的。