氨氮的浓度过高是造成水体富营养化的主要原因之一，水体中氮的去除对于维持水体清洁及防止水体的富营养化意义重大^{[1, 2]}。贾鲁河流经河南省东南部，属于淮河二级支流，主要接纳多个地市的污水，可生化性能较差，氨氮含量一直较高^[3]。生物脱氮技术是目前水处理领域研究的热点内容之一，而自20 世纪80 年代开始的异养硝化作用及其菌种的研究，是对传统硝化理论的丰富与发展^{[4, 5]}。与自养型硝化细菌相比，异养型硝化细菌的生长速率更快，细胞产量更高，需要的溶解氧浓度更低，耐酸性也更强^{[6, 7]}。目前报道较多的异养硝化菌主要有：副球菌属（Paracoccus sp.）^[8]、产碱杆菌属（Alcaligenes）^[9]、假单胞菌属（Pseudomonas）^[10]、不动杆菌属（Acinetobacter）^{[11, 12]}、芽孢杆菌（Bacillussp.）^[13]等，并且部分异养硝化菌同时具有好氧反硝化的作用^[14]，因此筛选异养硝化菌对河流中氨氮的彻底去除具有重要意义。

本研究在贾鲁河郑州段沿程选取10 个采样点采样，并从中分离、筛选出能在有机碳存在的条件下进行硝化作用的细菌，挑选出氨氮去除效果最好的一株，对其进行分子生物学鉴定，然后测定其生长曲线，并分析该菌株的氨氮去除特性，以及菌株去除氨氮时的影响因素，旨在为菌株的进一步应用提供理论支持。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品的采集及预处理

微生物样品取自郑州市纳污河流贾鲁河沿程的10 个采样点，各采样点均采集水样、泥样一份，带回实验室后冷藏保存备用。水样在富集前要取约250 mL 通过孔径为0.22 μm 的滤膜过滤，水中细菌截留在滤膜上，然后将滤膜放在液体培养基中直接培养，如果水中的悬浮物含量较高，则沉淀后再取水样的上清液进行过滤。由于底泥中的微生物含量较多，无需经过富集处理，直接对底泥进行分离纯化。微生物在分离纯化前，称取湿重为5 g 的底泥样品，加入到带玻璃珠且盛有50 mL 无菌水的三角瓶中，震荡30 min，使底泥样品均匀分布于水中。

异养硝化培养基：（NH₄）₂SO₄ 0.5g，丁二酸钠5.1 g，维氏盐溶液50 mL，加水溶解，并补加蒸馏水至1 L，调节培养基pH 为7.0-7.2，若培养基为固体需另加入2% 的琼脂粉。维氏盐溶液：K₂HPO₄ 5.0 g，MgSO₄·7H₂O 2.5 g，NaCl 2.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.05 g，MnSO₄·4H2O 0.05 g，溶解后加水定容至1 L。

取10 mL 处理后的样品加入盛有100 mL 灭菌后的异养硝化培养基的250 mL 锥形瓶中，在30℃、150 r/min 的条件下振荡培养4 d 左右，用萘氏试剂检测氨氮的转化情况，若用萘氏试剂显色较浅，即氨氮的含量变少，则移取1 mL 培养液转接入新鲜的富集培养基中继续富集^[15]，重复操作2-3 次。

经2-3 次富集之后，筛选出去除氨氮效果较好的富集样，采用梯度稀释涂布琼脂平板和平板划线分离的方法，对富集后的菌液进行分离纯化：制备样品梯度稀释液（用梯度稀释法制备10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5 和10^-6 的稀释液），分别取0.2 mL的10^-2、10^-4 和10^-6 的稀释液涂布于相应的固体培养基上，倒置于30℃的恒温培养箱中培养至菌落出现^[16]。挑取典型的菌落采用分区划线的方法进行纯化2-3 次。

将纯化后的所有菌株分别接种于液体的异养硝化培养基中，30℃、150 r/min 的条件下振荡培养3 d，培养期间每天用萘氏试剂检验各个培养基中氨氮的降解情况，同时做空白对照，选择氨氮去除效果最好的一株作为实验菌株。

委托上海生工生物工程股份有限公司对16S rDNA 的PCR 扩增产物进行序列测定，应用BLAST 软件将所得序列与Internet 上GenBank中的有关序列进行同源性分析。

1.2.4 生长特性的研究

将所筛菌株培养至稳定期然后接种于已灭菌的异养硝化液体培养基中，于30℃、150 r/min 条件下恒温培养48 h 后作为接种液使用。将准备好的接种液以10% 的比例（体积比）转接入4 个盛有100 mL 灭菌培养基的锥形瓶中，以空白培养基为对照。在30℃、150 r/min 条件下恒温培养，并于开始后0、4、8、12、16、20、24、28和32 h 时取样，测定培养液体中菌体的细胞密度OD₆₀₀ 的值，并取样在离心分离器中经3 000 r/min、10 min 离心分离，然后取上清液测定NH₄⁺-N、TN、NH₃^--N、NH₂^--N，分析其浓度变化。

将筛选出来的菌株按接种量0%、1%、3%、5%、7% 和10% 接种至 100 mL 新鲜培养基中，30℃、150 r/min 摇床培养，24 h 后检测氨氮的浓度转化情况。初始pH 值在此前实验的基础上，取100 mL 培养基置于250 mL 锥形瓶中，用1 mol/LHCl 或1 mol/L NaOH 调节培养基的pH 值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0，24 h 后检测氨氮的浓度转化情况。

在此前实验的基础上，分别改变碳源为葡萄糖、丁二酸钠、柠檬酸三钠（含碳量相等），24 h 后检测氨氮的浓度转化情况。

在此前实验的基础上，取100 mL 培养基置于250 mL 锥形瓶中，培养温度分别设置为15℃、20℃、25℃、30℃和35℃，24 h 后检测氨氮的浓度转化情况。

在此前实验的基础上，取100mL 培养基置于250 mL 锥形瓶中，摇床转速分别设置为100、150、200 和250 r/min，恒温培养24 h 后取样测定氨氮的去除情况。

1.2.6 分析方法

样品在经过3 000 r/min 的离心机离心10 min 后取上清液测定氮素含量。显色剂采用萘氏试剂、格里斯试剂和二苯胺；氨氮的测定采用纳氏试剂分光光度法（HJ535-2009）；亚硝态氮的测定采用N-（1-萘基）- 乙二胺分光光度法（GB/T7493-1987）；硝态氮的测定采用酚二磺酸分光光度法（HJ/T346-2007）；总氮的测定采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法（GB11894-89）；菌体数量采用分光光度计测定波长为600 nm 时的吸光度值来表征；pH 值的测定采用Delta320 型数字精密pH 计。

通过富集培养、分离和纯化，共获得16 株能在异养硝化培养基上生长的不同菌落形态的菌株。将这16 株菌株接种于异养硝化培养基，培养过程中，用萘氏试剂检测氨氮的去除效果，筛选出对萘氏试剂显色效果较好，即氨氮去除效果明显的菌株2 株C1 和C2。同时，分别用格里斯试剂和二苯胺对两株菌进行检测，发现这两株菌在培养过程中均具有亚硝态氮及硝态氮的少量积累，说明二者都具有异养硝化的特性。

分别用异养硝化培养基对C1 和C2 进行培养，以空白培养基作为对照，48 h 后测定氨氮的浓度变化。结果显示菌株C2 的氨氮去除率高于C1，为78.87%，因而选择C2 作为后续实验的菌种。

经过形态观察发现：C2 菌落呈圆形，透明的黄色，表面光滑，产生荧光物质，为革兰氏阴性菌。将本实验筛选到的菌株C2，委托上海生工生物工程股份有限公司对C2 的16S rDNAPCR 扩增产物进行序列测定，初步鉴定C2 属于假黄单胞菌属（Pseudoxanthomonas sp.）。

菌株在异养硝化培养基中的生长曲线及氮素转化情况，如图 1 和图 2 所示。图 1 显示，菌株C2 接种后经过短暂的调整后进入对数生长期，大约24 h左右菌体的生长量达到最大值，然后进入稳定期。

图 1 菌株C2 的生长曲线

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图 2 NH4 +-N、TN、NO2--N 和NO3--N 浓度随时间的变化

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图 2 显示，菌株C2 对NH₄⁺-N 的快速降解发生在前24 h，由94.31 mg/L 快速下降至19.93 mg/L，去除率达78.87%。进入稳定期后，NH₄⁺-N 的去除效果随之下降，TN 含量基本上在小范围内波动，NH₃^--N、NO₂^--N 都有积累。

当pH 为7.2、以丁二酸钠为唯一碳源、温度为30℃、摇床转速为200 r/min 时，分析不同接种量时的NH₄⁺-N 去除情况。结果（图 3）显示，菌株C2 在接种量为3% 时NH₄⁺-N 去除效率最高。当接种量小于3% 时，NH₄⁺-N 的去除率随着接种量的增加而增大，但当接种量超过3% 后，NH₄⁺-N 的去除率反倒有所降低。

图 3 接种量对菌株C2 氨氮转化性能的影响

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当接种量为3%、以丁二酸钠为唯一碳源、温度为30℃、摇床转速为200 r/min时，研究初始pH 对菌株脱氮效果的影响。结果（图 4）显示，菌株C2 在pH<6 或是pH>9 时NH₄⁺-N 的去除率都迅速降低，只有在pH7-9 时较高，并且在pH 为9 时NH₄⁺-N 的去除率达到最大值94.89%，pH升高到10 时，微生物的活性受到抑制，脱氮效果下降。

图 4 初始pH 对菌株C2 氨氮去除效率的影响

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pH 对NH₄⁺-N 浓度的测定有一定的影响，为降低实验误差，本研究另选取一组培养前的NH₄⁺-N含量数据进行分析，结果（表 1）显示，各组的NH₄⁺-N 含量均随pH 值的升高而呈现降低的趋势。

当接种量为3%、初始pH为9.0、温度为30℃、摇床转速为200 r/min 时，分别以葡萄糖、丁二酸钠、柠檬酸三钠为唯一碳源，分别以相应未接种的液体培养基作对照，培养24 h，分析各组NH₄⁺-N 的去除情况。结果（图 5）显示，以葡萄糖为唯一碳源培养24 h 后培养液基本清澈，菌株C2 的脱氮效率只有22.88%，而分别以丁二酸钠和柠檬酸三钠为唯一碳源时的脱氮效果均比较好，其中以丁二酸钠为唯一碳源时的效果最好，达到84.47%。

表 1 培养前各pH 条件下的氨氮含量

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图 5 碳源对菌株氨氮去除效率的影响

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当接种量为3%、初始pH 为9.0、以丁二酸钠为唯一碳源、摇床转速为200 r/min时，分别在不同的温度条件下培养菌株，分析温度对NH₄⁺-N 去除效率的影响。结果（图 6）显示，在温度为20℃-35℃之间时，菌株C2 对NH₄⁺-N 的去除效果差别不大，在温度为15℃时为82.80%。

当接种量为3%、初始pH为9.0、以丁二酸钠为唯一碳源、温度为20℃时，分析摇床转速对NH₄⁺-N 去除率的影响。结果（图 7）显示，摇床的震荡速度对菌株C2 的NH₄⁺-N 去除效率影响不大，在150 r/min 时NH₄⁺-N 去除率最高达97.80%，在低于或高于150 r/min 时NH₄⁺-N 去除率稍有降低。

图 6 温度对氨氮去除率的影响

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图 7 摇床转速对C2 去除氨氮效率的影响

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本研究所得到的菌株初步鉴定为假黄单胞菌属（Pseudoxanthomonas sp.），对氨氮具有较好的去除效果。并且该菌株经过短暂调整便进入对数生长期，体现了异养硝化菌相对于自养硝化菌具有较强的适应环境的能力，生长速度相对较快^[17]。但在培养的过程中如果时间较长，由于菌株C2 已经消耗掉了培养基中大量的营养物质，NH₄⁺-N 的去除效果也随之下降^[18]。在实验的过程中NH₃^--N、NO₂^--N 都有积累，说明在异养条件下菌株C2 有硝化作用，但两者积累量都不大，所以该菌株是否同时具有反硝化作用有待进一步探讨。

微生物的培养是一个非常复杂的过程，其脱氮性能的好坏受到很多因素的影响，如接种量、所选碳源，温度、pH 等。因而对菌株的培养条件进行优化十分必要。

培养基中细菌生物量的高低直接影响着氨氮转化效果的好坏^[19]。接种量小，微生物群体对环境的抵抗能力弱，相应的适应期就长，从而影响到NH₄⁺-N 的去除效率；接种量过大可提高氨氮转化率，在短时间内效果较好，但营养条件等受到限制，从而制约了细菌的继续生长，因而NH₄⁺-N 的去除率不再增大。

菌株的生长需要合适的pH，pH 值可影响酶活性、菌体对营养物质的吸收及菌体细胞的结构，从而影响菌体的生长和反应活性^[20]；此外，pH 对游离氨质量浓度有一定影响，废水中氨随pH 不同分别以离子态和分子态形式存在，从而影响菌种的活性。本实验中菌株C2 在中性及偏碱条件下的氨氮去除效果较好。

有机碳源不仅影响着异养硝化菌的生长，也影响着它的硝化活性^[21]，所以有机碳源的类型对异养硝化活性也起到至关重要的作用。能够被利用来维持异养硝化菌生长的碳源类型非常广泛，但能够被异养硝化菌利用来进行硝化反应的碳源类型却有所限制^[22]。本实验中以丁二酸钠为最佳碳源。

温度主要影响微生物酶的活性，从而影响其生长和代谢。温度过高或过低都不利于菌株酶活性的发挥，从而导致生长停滞，氨氮去除能力下降。有研究资料显示：一般温度在低于15℃或高于40℃时才会对异养硝化菌产生显著影响^[22]，但由于本实验设置的温度范围较窄，因此菌株C2 对于此温度范围外的脱氮效果还有待于进一步探讨。

摇床转速与培养基中的溶解氧浓度具有密切的关系，溶解氧对菌株的生长和代谢都有一定的影响。当振荡速度过高时，氨氮的去除率反而会下降，这可能是因为充足的溶解氧使细菌提前进入衰亡期菌体死亡自溶导致的^[23]。

本研究通过富集培养、分离纯化，从贾鲁河采集的样品中筛选出1 株繁殖速率较快且具有氨氮去除能力的菌株C2，在24 h 之内即可将氨氮浓度从94.13 mg/L 降低到19.89 mg/L，去除率达78.87% ；经分子生物学鉴定，初步确定该菌属于假黄单胞菌属（Pseudoxanthomonas sp.）；对菌株C2 的培养条件经行优化，当接种量为3%、以丁二酸钠为唯一碳源、pH 为6-9、温度为20℃-35℃时脱氮效率较高，培养条件均最佳时，氨氮去除率可达97.80%，在本研究中转速对其脱氮效果影响不大。