2. 云南省农业科学院药用植物研究所，昆明 650223）
2. Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650223
滇龙胆Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl. 是云南特色药材，也是200 多种中药的主要原料[1]。近年来，随着龙胆需求量逐年递增，导致其野生资源遭到大肆破坏[1]。为此，2013 年云南省启动了龙胆草航天育种工程，其主要目标是培育高产、高抗、高龙胆苦苷含量、适合机械化种植和扩大种植范围的龙胆草新品种[2]。滇龙胆主要活性成分为龙胆苦苷，要从根本上解决龙胆药源问题和提高其龙胆苦苷含量，首先必须探明龙胆苦苷生物合成途径及其调控机理，为通过现代生物技术手段生产龙胆苦苷奠定基础。
龙胆苦苷属于裂环环烯醚萜类化合物。在植物中，裂环环烯醚萜类骨架部分主要是通过质体2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径合成的[3]。1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose5-phosphate synthase，EC ：4.1.3.37）是MEP 途径中的第一个催化酶，在焦磷酸硫胺素的存在下，能够将丙酮酸与D-甘油醛3-磷酸缩合生成1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸（DXP），同时释放二氧化碳，该反应依赖于Mg2+ 或Mn2+ 等二价阳离子[4, 5, 6]。研究表明DXS 催化丙酮酸的脱羧速率能够被甘油醛3-磷酸所加速[7]。采用LC-MS-MS 方法，通过检测DXP 的产生而测定植物粗提取物中DXS 酶活性的方法已被报道[8]。目前，1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因已从水稻[9]、玉米[10]、苜蓿[11]、云杉[12]、沉香[13]、熊胆草[14]、甜瓜[15]、印度人参[16]等多种植物中分离。DXS 基因的表达具有组织特异性，并被生物和非生物因素诱导。在生物诱导剂（100 mg/mL 酵母提取物）和非生物诱导剂（30 mmol/L Ag+）共同诱导36 h，丹参SmDXS 基因在诱导后其表达量逐渐升高，在36 h 时表达量达到最高[17]。在葡萄中，VvDXS 基因与麝香葡萄香味相关联，其表达受染色质状态和不同发育时期的影响[18]。
在日本，龙胆是重要的鲜切花，其研究主要集中于花色改良方面[19, 20]。在中国，龙胆是重要的大宗药材，其研究主要集中于种子萌发[21, 22]、DNA条码[23]、育种[2]等方面，尚未对滇龙胆GrDXS 基因进行研究。本研究根据滇龙胆转录组中GrDXS 基因序列，设计一对特异性引物，通过RT-PCR 技术从滇龙胆幼叶中扩增到GrDXS 基因，并进行序列分析、原核表达和组织表达特异性分析，以期为滇龙胆GrDXS 基因功能和龙胆苦苷生物合成途径的解析奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料滇龙胆无菌组培苗和盆栽苗均采自于玉溪师范学院分子生物学实验室，由云南省农业科学院药用植物研究所金航研究员鉴定为滇龙胆Gentianarigescens Franch. ex Hemsl.。基因克隆所用材料为滇龙胆无菌苗幼叶，基因组织特异性表达分析所用材料为盆栽3 年生滇龙胆的根和叶，采样日期为2014年5 月17 日。
1.2 方法 1.2.1 叶片总RNA 提取及GrDXS 基因ORF 的克隆按照多糖植物组织提取试剂RNAiso（TaKaRa，大连）说明书提取滇龙胆幼叶总RNA ；按照逆转录试剂盒（TaKaRa，大连）说明书合成cDNA。根据原核表达载体pGEX-4T-1 多克隆酶切位点和滇龙胆转录组中GrDXS 基因序列，设计一对特异引物GrDXSBamHI-F ：5'-GGATCCATGGCAGTTTCAGGATCTCTC-3'（ 下划线为BamH I 酶切位点），GrDXSXhoI-R ：5'-CTCGAGTTACTTAAGCTGAAGAGCTTCTTTAGG-3'（下划线为Xho Ⅰ 酶切位点，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成）。以cDNA 为模板进行PCR 扩增，反应体系为：PrimeSTAR MaxPremix（2×）（TaKaRa，大连）25 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA 模板3 μL，加ddH2O 补足50 μL。PCR 反应条件为：98℃变性10 s，55.4℃退火15 s，72℃延伸10 s，30 循环。PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离、割胶，使用胶回收试剂盒（Qiagen，德国）对目的片段进行回收；使用dATP（TaKaRa，大连）和Taq DNA Polymerase（天根，北京）进行加尾，72℃反应30 min ；加尾产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离、割胶，使用胶回收试剂盒（Qiagen，德国）对目的片段进行回收，然后将其连接到pMD19-T 载体（TaKaRa，大连）。转化大肠杆菌DH5α（TaKaRa，大连）后进行蓝白筛选，挑取12 个白斑摇菌；使用碱裂解法提取质粒，经酶切检测正确后选取3 个克隆进行测序（上海生工，上海），获得重组质粒pMD19-GrDXS。
1.2.2 GrDXS 基因原核表达载体构建对质粒pGEX-4T-1（Amersham，瑞典）和pMD19-GrDXS 分别进行BamH I（TaKaRa，大连）和Xho Ⅰ（TaKaRa，大连）双酶切，回收载体片段和目的基因，按摩尔比1∶4 进行过夜连接，然后转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞（TaKaRa，大连），涂布于添加100 mg/L氨苄青霉素（TaKaRa，大连）+ IPTG（TaKaRa，大连）+ X-gal（TaKaRa，大连）的LB 固体平板，12 h后挑取克隆；摇菌后，提取质粒，经酶切检测正确后，获得原核表达载体pGEX-4T-1-GrDXS。
1.2.3 GrDXS 基因的生物信息学分析使用NCBI网站BLAST 程序进行序列比对，应用Genetyx 6.1.8进行翻译，使用DNAMAN 7 进行多序列比对；使用Clustal X2.1 进行比对，然后使用MEGA6.0 软件内置的NJ 法构建系统进化树，设置Bootstrap=1 000 ；利用在线数据库（http://molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.html） 进行稀有密码子分析。使用ChloroP 服务器v1.1 进行叶绿体转运肽预测；Interpro 软件进行保守结构域预测；ProtScale 软件进行疏水性分析；PredictProtein 对二级结构进行预测；Swiss-Model 自动模式对三级结构进行预测；利用ExPASy 中的TMHMM 工具预测蛋白的跨膜螺旋区；利用在线工具WOLF PSORT 预测蛋白的亚细胞定位情况。
1.2.4 GrDXS 基因的原核表达使用热激法将重组质粒pGEX-4T-1-GrDXS 转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞（全式金，北京），挑取单菌落接种于3 mL 含100 mg/L 氨苄青霉素的LB 液体培养基中，37℃、250 r/min 培养12 h。然后以1∶100 比例接种到无抗生素的LB 液体培养基中，37℃、250 r/min培养3 h（OD600≈0.8），在37℃、终浓度为1 mmol/LIPTG 诱导下进行表达，同时以相同条件的pGEX-4T-1 转化菌作对照；分别诱导0、2、4 和6 h 后，收集菌液2 mL。4℃、10 000 r/min 离心1 min 集菌，弃上清，加入100 μL ddH2O、25 μL 的5×SDSPAGE上样缓冲液，震荡悬菌，沸水煮5 min。4℃、13 000 r/min 离心5 min。取20 μL 上清上样，进行SDS-PAGE（5% 浓缩胶和12% 分离胶）电泳检测。4℃、6 000 r/min 离心10 min，将诱导表达6 h 的菌液50 mL 进行收集，使用1×PBS 对菌体进行洗涤1 次。然后加入5 mL 1×PBS 进行悬菌，使用JY92-ⅡDN 型超声细胞破碎仪（新芝，宁波）进行细胞破碎。条件为：冰浴，超声时间30 min，工作3 s，间隔3s，能量30%。4℃、18 000 r/min 离心30 min，分离上清和沉淀。使用SDS-PAGE 检测目的蛋白。
1.2.5 GrDXS 基因的实时定量分析分别取3 年生滇龙胆的根和叶，提取总RNA，使用DNase Ⅰ 处理除去基因组DNA。使用反转录试剂盒（TaKaRa，大连）合成第一链cDNA。以转录组中GrGAPDH 基因（GenBank 登录号KM061807）作为内参设计引物GrGAPDH-F（5'-AAGGGAGGTGCGAAGAAAGT-3'）和GrGAPDH-R（5'-AAGGAGCAAGACAGTTGGTTGT-3'），PCR 反应条件为：95℃ 3 min，95℃ 15 s，60℃ 31 s。根据GrDXS 基因的cDNA 序列设计特异性引物GrDXS-F（5'-TGATAGTGATGGCACCTTCTGA-3'） 和GrDXS-R（5'-TTCTTCCCTTACCAACCTCAAA-3'）。使用SuperReal PreMix Plus 试剂盒（天根，北京）进行qPCR，PCR 反应条件为：95℃ 3 min，95℃ 15 s，60℃ 31 s。每个反应重复3 次。反应在ABI7000 荧光定量PCR 仪（Applied Biosystems，美国）上进行扩增，扩增曲线、熔解曲线、标准曲线由定量PCR 仪软件自动生成。使用内参基因GrGAPDH表达校准后，计算根茎叶中GrDXS 基因相对表达量。采用比较Ct 值的“2-△△Ct”的方法进行定量数据的分析处理。
2 结果 2.1 滇龙胆GrDXS基因序列的克隆以滇龙胆幼叶cDNA 为模板，使用特异性引物扩增出约2 000 bp 的片段（图 1）。通过TA 克隆获得重组质粒pMD19-GrDXS，酶切检测结果表明双酶切获得的两片段大小之和等于单酶切片段大小，与预期结果相符。
|
| 图 1 GrDXS 基因的PCR 扩增 |
利用Genetyx 和DNAMAN 软件对GrDXS 基因cDNA 序列进行分析，结果显示GrDXS 基因ORF全长2 142 bp，编码713 个氨基酸。值得注意的是，本研究中克隆到的GrDXS 基因与转录组拼接的GrDXS 核苷酸序列不完全一致，二者相似性为99.53%。将该序列上传至GenBank 数据库，获得登录号KM974886。
使用GenBank 数据库中的BLASTp 程序对GrDXS 蛋白进行比对分析，结果表明滇龙胆GrDXS与长春花CrDXS 蛋白序列相似性最高（87.96%），与高良姜（Alpinia officinarum）AoDXS（AEK69519.1）蛋白相似性稍低（74.40%）。利用DNAMAN 7 将GrDXS 蛋白序列与从NCBI 中挑选的相似性较高的部分序列进行多序列比对分析，结果（图 2）表明GrDXS 蛋白与已知蛋白相似性很高。利用Mega 6.0将GrDXS 蛋白序列与已发表文献中相似性较高的序列进行系统发育分析，结果（图 3）显示，编码滇龙胆GrDXS 蛋白与长春花CrDXS2a 处于同一进化枝，表明二者亲缘关系较近。
|
| 图 2 GrDXS 蛋白与其它植物DXS 蛋白的多序列比对结果 |
|
| 图 3 GrDXS 蛋白与植物中其它DXS 蛋白的系统发育分析 |
使用ExPASy ProtParam tool 对GrDXS 蛋白进行理化性质分析，结果表明GrDXS 蛋白单体相对分子质量为76.75 kD，pⅠ 为6.93 ；带正电氨基酸残基（Arg+Lys）为74，带负电氨基酸残基（Asp+Glu）为76。不稳定指数为35.27，属于稳定蛋白；脂肪指数为90.90，总平均疏水性（GRAVY）为-0.072，为亲水蛋白。GrDXS 蛋白含有20 种基本氨基酸，其中丙氨酸含量最高，为10.40% ；其次是亮氨酸和甘氨酸，分别为9.70% 和9.40% ；色氨酸含量最低，为0.3%。
利用SSpro 方法对GrDXS 蛋白进行二级结构分析，结果表明该蛋白二级结构中α-螺旋（H）占34.45%，无规则卷曲（C）占47.06%，延伸带（E）占18.49%。利用Swiss-Model Workspace 使用自动模式预测GrDXS 蛋白的三级结构，结果如图 4 所示，该模型是以耐辐射球菌1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶[2o1x.1]为模板，在第69-705 位氨基酸处建模，序列相似度为41.50%，其二聚体配基为Mg2+或焦磷酸硫胺素。使用InterPro 在线工具对GrDXS蛋白的保守结构域进行分析，结果表明GrDXS 蛋白包含4 类保守结构域：焦磷酸硫胺素结合折叠域（IPR029061，69-425、366-555、87-268、315-407、407-558）、类转酮酶嘧啶结合结构域（IPR005475，394-559、394-555）、转酮酶C 端/ 丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶结构域Ⅱ（IPR009014，568-704，572-704）、转酮酶C 端结构域（IPR005476，573-696） 和1 个转酮酶结合位点（IPR020826，500-516）。
|
| 图 4 GrDXS 蛋白二聚体的三维结构预测 |
利用SignalP 4.1 服务器分析GrDXS 蛋白，未发现信号肽，表明该蛋白为非分泌型蛋白。利用TMHMM 工具预测GrDXS 蛋白的跨膜螺旋区，结果表明GrDXS 蛋白不含跨膜螺旋区域，为非膜蛋白。使用ChloroP 1.1 Server 对GrDXS 蛋白的叶绿体转运肽进行预测，结果表明GrDXS 蛋白含35 氨基酸组成的叶绿体转运肽，因此该蛋白定位于叶绿体。
对GrDXS 基因进行稀有密码子分析，结果表明GrDXS 基因中稀有密码子仅占0.84%，且无二联或三联稀有密码子连续出现的情况，因此可选用大肠杆菌表达菌BL21 或Rosetta（DE3）进行原核表达。
2.3 GrDXS基因原核表达载体的构建使用BamH I 和Xho Ⅰ 双酶切质粒pGEX-4T-1-GrDXS，可获得目的片段和载体（图 5），表明GrDXS基因已成功插入载体pGEX-4T-1 中。
|
| 图 5 质粒pGEX-4T-1-GrDXS 酶切检测 |
将重组质粒pGEX-4T-1-GrDXS 转化大肠杆菌Rosetta（DE3） 后，使用IPTG 进行诱导表达。在37℃、终浓度为1 mmol/L IPTG 下，分别诱导表达0、2、4 和6 h 后，提取细菌总蛋白进行SDS-PAGE 分析。结果表明，与对照相比，pGEX-4T-1-GrDXS 转化菌经IPTG 诱导后，在相对分子质量约100 kD（含GST 蛋白26 kD）处有1 条蛋白条带，并且随诱导时间增加其蛋白含量逐渐增加，表明重组质粒pGEX-4T-1-GrDXS 在大肠杆菌Rosetta（DE3）中成功诱导表达了GrDXS 蛋白。当温度为37℃、诱导时间为6h 时，蛋白表达量最大（图 6）。为检测GrDXS 融合蛋白的存在形式，对诱导表达6 h 的菌体进行超声破碎，然后使用SDS-PAGE 检测，结果（图 7）表明GrDXS 蛋白全部以包涵体形式存在。
|
| 图 6 37℃下诱导时间对GrDXS 蛋白表达量的影响 |
|
| 图 7 GrDXS 融合蛋白存在形式的检测 |
取3 年生滇龙胆的根和叶，通过qRT-PCR 分析GrDXS 基因在不同组织中的表达情况。结果（图 8）表明，GrDXS 基因在叶中表达量远高于其在根中表达量。
|
| 图 8 GrDXS 基因在根和叶中的相对表达 |
代谢途径中终产物的量取决于该途径的流量，而流量本身又取决于转换相应中间产物的每个酶反应步骤的速率[8]。鉴定对代谢通量起重要作用的酶，将有助于对萜类化合物生物合成调控机制的阐明[8]。滇龙胆的主要药效成分龙胆苦苷属于裂环环烯醚萜类，主要通过MEP 途径合成。在植物中，1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶被认为是MEP 途径的一个限速酶[14, 24]。因此，滇龙胆中GrDXS 基因的表达情况直接或间接影响龙胆苦苷的生物合成。本研究对滇龙胆GrDXS 基因进行克隆和生物信息学分析，结果表明所克隆的GrDXS 基因ORF 全长2 142 bp，编码713 个氨基酸，pⅠ 为6.93，这分别与印度人参WSDXS 蛋白和牛巴贝斯虫BbDXS 蛋白类似[16, 25]；GrDXS 蛋白具有DXS 蛋白中4 类保守结构域：焦磷酸硫胺素结合折叠域、类转酮酶嘧啶结合结构域、转酮酶C 端/ 丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶结构域Ⅱ、转酮酶C 端结构域，与长春花CrDXS 蛋白序列相似性高达87.96%，因此所克隆基因为GrDXS 基因。
在植物中，DXS 基因是以家族形式存在的[26]。根据系统发育分析、生化特征和基因表达特征，DXS 蛋白可分为3 类：第Ⅰ 类是在绿色组织中组成型表达，能够为持家代谢物或光合作用代谢物如类胡萝卜素和叶绿素的合成提供前体；第Ⅱ 类是在特定组织中表达，如与菌根共生累积前胡萝卜素的根或小蠹或真菌感染针叶松树脂道表皮细胞；第Ⅲ 类是最近几年才提出的，其功能还未被最终确定[15]。在本研究中，系统发育分析结果表明GrDXS 蛋白属于第Ⅱ 类DXS 蛋白，由于其又包含35 个氨基酸的叶绿体转运肽，推测其在叶绿体中参与MEP 途径。
DXS 基因的表达具有组织和时空特异性，并与萜类的生物合成相关联。在熊胆草中，CbDXS 基因的表达水平与其药效成分二萜苦蒿素的浓度高度相关[14]，而在拟南芥中AtDXS 能够通过MEP 途径控制二氧化碳的代谢流量[6]。在烟草中，过表达SlDXS 和香叶基焦磷酸合成酶基因NtGPPS2 导致二萜产量加倍[27]。在滇龙胆中，龙胆苦苷是在植物绿色组织（叶和茎）合成，然后通过茎转运到根中进行储藏的[28]。对滇龙胆GrDXS 基因组织表达特异性检测结果表明，GrDXS 基因在叶中的表达量远远高于根，这与上述报道相一致。
本研究为滇龙胆GrDXS 基因功能的解析奠定基础。下一步将对GrDXS 蛋白进行纯化和多克隆抗体制备、通过过表达或互补实验研究GrDXS 基因的功能，为龙胆苦苷生物合成途径的阐明奠定基础。
4 结论本研究成功克隆滇龙胆GrDXS 基因，并可表达出gst-DXS 蛋白，且该基因在叶中表达量远远高于根中。
| [1] | 金航, 张霁, 张金渝, 等. 滇龙胆[M]. 昆明:云南科技出版社, 2013 :1-5. |
| [2] | Gu Y. The gentian returned after travelling by spacecraft Shenzhou- 10 which suggested that space breeding project has been started in Yunnan Province[DB/OL]. Available from :http://www.chinanews.com/gn/2013/07-12/5037538.shtml, 2013-7-12. |
| [3] | Hua W, Zheng P, He Y, et al. An insight into the genes involved in secoiridoid biosynthesis in Gentiana macrophylla by RNA-seq[J]. Mol Biol Rep, 2014, 41(7):4817-4825. |
| [4] | Lois LM, Campos N, Putra SR, et al. Cloning and characterization of a gene from Escherichia coli encoding a transketolase-like enzyme that catalyzes the synthesis of D-1-deoxyxylulose 5-phosphate, a common precursor for isoprenoid, thiamin, and pyridoxol biosynthesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(5):2105-2110. |
| [5] | Xiang S, Usunow G, Lange G, et al. Crystal structure of 1-deoxy- D-xylulose 5-phosphate synthase, a crucial enzyme for isoprenoids biosynthesis[J]. J Biol Chem, 2007, 282(4):2676-2682. |
| [6] | Wright LP, Rohwer JM, Ghirardo A, et al. Deoxyxylulose 5-phosphate synthase controls flux through the methylerythritol 4-phosphate pathway in Arabidopsis[J]. Plant Physiol, 2014, 165(4):1488- 1504. |
| [7] | Patel H, Nemeria NS, Brammer LA, et al. Observation of thiaminbound intermediates and microscopic rate constants for their interconversion on 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase :600-fold rate acceleration of pyruvate decarboxylation by D-glyceraldehyde- 3-phosphate[J]. J Am Chem Soc, 2012, 134(44):18374-18379. |
| [8] | Rodríguez-Concepción M. Plant isoprenoids[M]//Wright L, Phillips M. Measuring the activity of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase, the first enzyme in the MEP pathway, in plant extracts. New York :Springer, 2014 :9-20. |
| [9] | Kim BR, Kim SU, Chang YJ. Differential expression of three 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase genes in rice[J]. Biotechnol Lett, 2005, 27(14):997-1001. |
| [10] | Cordoba E, Porta H, Arroyo A, et al. Functional characterization of the three genes encoding 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase in maize[J]. J Exp Bot, 2011, 62(6):2023-2038. |
| [11] | Floβ DS, Hause B, Lange PR, et al. Knock-down of the MEP pathway isogene 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase 2 inhibits formation of arbuscular mycorrhiza-induced apocarotenoids, and abolishes normal expression of mycorrhiza-specific plant marker genes[J]. Plant J, 2008, 56(1):86-100. |
| [12] | Phillips M, Walter M, Ralph S, et al. Functional identification and differential expression of 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase in induced terpenoid resin formation of Norway spruce(Picea abies)[J]. Plant Mol Biol, 2007, 65(3):243-257. |
| [13] | Xu Y, Liu J, Liang L, et al. Molecular cloning and characterization of three cDNAs encoding 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate synthase in Aquilaria sinensis(Lour. )Gilg[J]. Plant Physiol Biochem, 2014, 82 :133-141. |
| [14] | Sun R, Liu S, Gao JL, et al. Cloning and expression analysis of 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase gene from the medicinal plant Conyza blinii H. Lév[J]. Turk J Biol, 2014, 38(5):664- 670. |
| [15] | Saladie M, Wright LP, Garcia-Mas J, et al. The 2-C-methylerythritol 4-phosphate pathway in melon is regulated by specialized isoforms for the first and last steps[J]. J Exp Bot, 2014, 65(17):5077-5092. |
| [16] | Gupta P, Agarwal AV, Akhtar N, et al. Cloning and characterization of 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway genes for isoprenoid biosynthesis from Indian ginseng, Withania somnifera[J]. Protoplasma, 2013, 250(1):285-295. |
| [17] | Gao W, Sun HX, Xiao H, et al. Combining metabolomics and transcriptomics to characterize tanshinone biosynthesis in Salvia miltiorrhiza[J]. BMC Genomics, 2014, 15 :73. |
| [18] | Battilana J, Emanuelli F, Lorenzi S, et al. IX international symposium on grapevine physiology & biotechnology[C]. Chile : La Serena, 2013. |
| [19] | Nakatsuka T, Yamada E, Saito M, et al. Heterologous expression of gentian MYB1R transcription factors suppresses anthocyanin pigmentation in tobacco flowers[J]. Plant Cell Rep, 2013, 32(12): 1925-1937. |
| [20] | Nakatsuka T, Saito M, Yamada E, et al. Isolation and characterization of GtMYBP3 and GtMYBP4, orthologues of R2R3-MYB transcription factors that regulate early flavonoid biosynthesis, in gentian flowers[J]. J Exp Bot, 2012, 63(18):6505-6517. |
| [21] | Zhang J, Zhang J, Wang Y, et al. Effects of tree species on seed germination and seedlings growth of Chinese medicinal herb Gentiana rigescens[J]. Allelopathy J, 2012, 29(2):325-332. |
| [22] | Zhang J, Wang Y, Yang T, et al. Use of gibberellic acid to overcome the allelopathic effect of a range of species on the germination of seeds of Gentiana rigescens, a medicinal herb[J]. Seed Sci Technol, 2012, 40(3):443-447. |
| [23] | Wong KL, But PP, HShaw PC. Evaluation of seven DNA barcodes for differentiating closely related medicinal Gentiana species and their adulterants[J]. Chin Med, 2013, 8(1):16. |
| [24] | Estévez JM, Cantero A, Reindl A, et al. 1-Deoxy-D-xylulose-5- phosphate synthase, a limiting enzyme for plastidic isoprenoid biosynthesis in plants[J]. J Biol Chem, 2001, 276(25): 22901-22909. |
| [25] | Wang J, Shen YM, Li B, et al. Characterization of a functionally active recombinant 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase from Babesia bovis[J]. J Vet Med Sci, 2014, 76(7):1021-1027. |
| [26] | Peng G, Wang C, Song S, et al. The role of 1-deoxy-d-xylulose-5- phosphate synthase and phytoene synthase gene family in citrus carotenoid accumulation[J]. Plant Physiol Biochem, 2013, 71 : 67-76. |
| [27] | Brückner K, Tissier A. High-level diterpene production by transient expression in Nicotiana benthamiana[J]. Plant Methods, 2013, 9(1):46. |
| [28] | 朱宏涛, 郑传伟, 赵平, 等. 野生坚龙胆及其组培苗中龙胆苦苷的含量分析[J]. 天然产物研究与开发, 2011, 23(3): 482-485. |