谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidases，GPXs）是维持细胞内H₂O₂ 稳态的关键酶^[1]，它通过催化还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）与H₂O₂ 反应生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）及水，从而阻止羟基自由基（·OH）的产生，避免由其引发的质膜过氧化，进而保护细胞膜结构和功能的完整性^[2]。 由多个成员组成的GPXs 广泛存在于动物和植物中，目前已发现植物体GPXs 为诱导型表达，在不同胁迫条件下，编码GPXs 基因的mRNA 呈现不同水平的表达，GPXs 在植物抗氧化过程中可能具有重要作用^{[3, 4]}，因此关于植物中GPXs 的相关研究备受关注，包括GPXs 家族成员的获得、结构特征的阐释，以及应答胁迫的表达模式和亚细胞定位等^{[5, 6, 7]}。

盐芥（Thellungiella salsuginea）是模式植物拟南芥的近缘物种，与拟南芥具有相似的生物学特征^[8]，且二者的cDNA 序列同源性高达90%-95%^{[9, 10]}，但属于盐生植物的盐芥却能够在含有500 mmol/L NaCl 的高盐环境或 -15℃的低温条件下生存^[11]，具有强耐逆性。此外由于盐芥具有模式植物的生物学特性，因此被作为耐盐性研究的模式植物^{[12, 13]}。研究表明，拟南芥中AtGPXs 由8 个成员组成，其中AtGPX3 不仅可以作为氧化信号传感器，还能在干旱胁迫下清除植物体内多余的脱落酸（Abscisic acid，ABA），响应ABA 和干旱胁迫，这种双重机制在其他植物中也具有相似性^[14]。本实验室前期对盐芥TsGPXs 家族的8 个成员进行了研究，皆具有3 个典型的GPXs 特征结构域，同时在应答不同胁迫时表达模式不同。 在8 个TsGPXs 成员中，只有TsGPX3 具有跨膜结构域，属于分泌蛋白，亚细胞定位预测分析显示可能定位在内质网或质膜上^[7]。本研究通过构建植物表达载体、利用PEG 介导拟南芥原生质体的瞬时表达进行TsGPX3 亚细胞定位研究；构建原核表达载体，对蛋白表达条件进行初步研究，旨在为进一步研究 TsGPX3 与盐芥抗逆性关系及植物GPXs 的功能研究提供依据。

盐芥山东生态型种子为本实验室保存。Trizol 试剂购自Invitrogen 公司，反转录酶M-MLV、pGEM-T 载体、pET28a、限制性内切酶Nde I 和Sal I 购自 Promega 公司，大肠杆菌（Escherchia coli）DH5α 和 BL21（DE3）购自北京博迈德科技发展有限公司，pRTL2 表达载体由北京师范大学惠赠，限制性内切酶Xho I 和Xba I 购自Fermentase 公司，ECL 试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，考马斯亮蓝R-250 购自北京百泰克生物技术有限公司，PVDF 膜购自Millipore 公司，辣根过氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗小鼠IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司，根据盐芥TsGPXs 蛋白序列设计的盐芥TsGPX 特异抗体（TsGPX-A）由北京华大蛋白质研发中心制备。

室内培养盐芥实生苗，培养基质为营养土∶蛭石= 3∶1 的混合土，培养条件为光周期16 h/d，光照强度93 μmol/（m²·s），相对湿度 60%/80%（ 昼/ 夜），温度为23℃/18℃（ 昼/ 夜），用Hoagland 营养液浇灌。生长8 周后，以Hoagland 营养液配制300 mmol/L NaCl 溶液，采用根灌法处理盐芥幼苗12 h 后取样，迅速冻于液氮中，保存于-80℃，用于总RNA 的提取。

采用Trizol 法提取盐芥总RNA。以盐芥总 RNA 为模板，用M-MLV 反转录酶合成cDNA，操作步骤按说明书进行。

根据本实验室前期获得的TsGPX3 基因序列设计引物，引物序列为F1 ：5'-TGTCGATGCCTAAATCAAGC- 3'/ R1 ：5'-GAAAATGAGATTCACACTGGTACTC- 3'。以反转录得到的cDNA 为模板进行PCR 扩增，扩增条件为：95℃预变性3 min ；95℃变性30 s，54℃退火50 s，72℃延伸50 s，共30 个循环；72℃ 延伸7 min。PCR 扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的条带，回收产物与pGEM-T 载体连接，转化E.coli DH5α 感受态细胞，并送至北京华大基因公司进行测序。

在NCBI 搜索与 TsGPX3 同源性较高的16 种植物GPX3 序列，采用 MEGA 5.0 进行系统进化分析。

对TsGPX3 基因序列和含有绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein，GFP）的植物表达载体pRTL2-GFP 进行酶切图谱分析，设计含酶切位点的引物F2 ：5'-CCGCT CGAGCGATGCCTAAATCAAGCACTTGG-3'（ 下划线部分为Xho I 的酶切位点）/ R2 ：5'-GCTCTAGATCA AGCAGATGCCAATAGCTTC-3'（下划线部分为Xba I 的酶切位点）。利用限制性内切酶Xho I 和Xba I 将 TsGPX3 构建入pRTL2 的C 端GFP 载体中，获得重组质粒pRTL2-TsGPX3-GFP，转化至E.coli DH5α 中，菌液PCR 鉴定与测序验证。

制备拟南芥叶片细胞的原生质体，将鉴定正确的重组质粒pRTL2-TsGPX3-GFP 和空载体pRTL-GFP分别以PEG 介导转化拟南芥原生质体，用激光共聚焦显微镜观察GFP 标签的表达。

设计含有酶切位点的引物F3 ：5'-GGGAATTCCATATGCGATGCCTAAATCAAGCACTTGG- 3'（下划线部分为Nde I 酶切位点）/ R3 ：5'-ACGCGTCGACTCAAGCAGATGCCAATAGCTTC- 3'（下划线部分为Sal I 的酶切位点）。利用限制性内切酶Nde I 和Sal I 将 TsGPX3 构建入 pET28a 载体中，获得重组质粒pET-TsGPX3。将重组质粒pET-TsGPX3 和pET28a 空载体分别转化至 E.coli BL21（DE3）中，筛选阳性克隆进行酶切与测序验证。

分别将含有重组质粒pET-TsGPX3 和空载体 pET28a 的E.coli BL21（DE3） 接种于含氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）的10 mL LB 液体培养基，于 37℃条件下振荡培养。在菌液到达对数期（OD₆₀₀ 为 0.8 左右）时加入终浓度为1 mmol/L 异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导。分别取1 mL 菌液，在 37℃下分别培养1、2、3、4 和5 h，以确定最佳表达时间。分别取1 mL 菌液，在16℃、28℃和37℃ 分别培养5 h 时，以确定最佳表达温度。分别收集上述条件下所得菌体。每个样品取5 μL 进行SDSPAGE 电泳，考马斯亮蓝R-250 染色，检测融合蛋白的表达情况。

SDS-PAGE 电泳后，将未进行染色的凝胶转硝酸纤维素膜（ 转膜15 V，30 min），加入5% 脱脂奶封闭液，于 100 r/min 的摇床上室温封闭30 min。 加入一抗（TsGPX-A 抗体），于100 r/min 的摇床上 37℃孵育1 h，用TBST 洗3 遍，5 min/ 次。加入二抗（HRP 标记的山羊抗小鼠IgG），于100 r/min 的摇床上37℃孵育1 h，用TBST 洗3 遍，5 min/ 次。 用ECL 试剂盒进行显色，将试剂盒A、B 液1∶1 混合配成2 mL 溶液，室温孵育PVDF 膜1 min，用凝胶成像系统观察。

以引物序列F1/R1 扩增TsGPX3 的全长cDNA 序列，大小为776 bp，其中6-596 bp 为开放阅读框（ORF），编码196 个氨基酸（图 1）。TsGPX3 蛋白的理论相对分子量为23.258 kD，理论等电点为7.33。 TsGPX3 具有植物GPX 蛋白活性中心的3 个保守Cys （C）残基以及3 个保守特征结构域（催化结构域 NVASKCG、标志性基序ILAFPCNQF 和PHGPX 的特征基序KWNFAKFL），且3 个保守结构域中各含有1 个催化氨基酸残基，即C、Q 和W（图 2）。

图 1 盐芥TsGPX3 基因全长cDNA 的PCR 扩增产物

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图 2 TsGPX3 的核苷酸及推测的氨基酸序列

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为了研究TsGPX3 的进化关系，采用MEGA 5.0 对TsGPX3 及与TsGPX3 同源性较高的16 种植物 GPX3 序列进行系统进化树分析，结果（图 3）显示，盐芥TsGPX3 与同属于十字花科的萝卜（Raphanus sativus）RsGPX3、油菜（Brassica napus）BnGPX3、 花椰菜（Brassica oleracea）BoGPX3、拟南芥（Arabidopsis lyrata）AlyGPX3 和拟南芥（A. thaliana）At- GPX3 同源性较高，聚为一类。与非十字花科的高粱 （Sorghum bicolor）SbGPX3、玉米（Zea mays）ZmGPX3 、水稻（Oryza sativa）OsGPX3、大麦（Hordeum vulgare）HvGPX3、蓝桉树（Eucalyptus globulus）EglGPX3 、巨桉（Eucalyptus grandis）EgrGPX3 以及小麦（Triticum aestivum）TaGPX3-1A、TaGPX3-1B、Ta- GPX3-1D 的同源性较低。另外，研究发现，上述物种与莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）CreGPX3 和小立碗藓（Physcomitrella patens）PpaGPX3 的同源关系均较远。

图 3 盐芥TsGPX3 及其他植物GPX3 序列的系统进化分析

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将pRTL2 空载体和经过鉴定的pRTL2-TsGPX3- GFP 载体以PEG 介导分别转化拟南芥原生质体，结果见图 4。pRTL2 空载体亚细胞定位结果（图 4-A） 显示，GFP 荧光蛋白在细胞的各个部位都有表达，显示清晰的GFP 绿色荧光信号。pRTL2- TsGPX3-GFP 载体亚细胞定位结果（图 4-B）显示，TsGPX3∷GFP 融合蛋白仅在细胞膜位置产生荧光，由此推测TsGPX3 基因所编码的蛋白主要定位在细胞膜上，与生物信息学预测结果基本一致。

图 4 空载体（A）及盐芥TsGPX3（B）亚细胞定位结果

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以未被IPTG 诱导的pET28a 空载体为对照，将经过鉴定的含有重组质粒pET-TsGPX3 的E.coli BL21 （DE3） 在IPTG 诱导下表达1、2、3、4 和5 h 后进行SDS-PAGE 电泳，结果（图 5-A）显示，含有 pET-TsGPX3 表达载体的E.coli BL21（DE3）在不同诱导条件下、在27 kD 附近都出现1 条新的特异条带，与TsGPX3 预测大小基本一致，pET28a 空载体没有特异蛋白表达。在5 个诱导时间（1、2、3、4 和5 h） 处理中，TsGPX3 融合蛋白的表达呈逐渐上升趋势，在5 h 达到最高；在3 个处理温度（16℃、28℃和 37℃）下表达5 h，TsGPX3 融合蛋白的表达量逐渐增加，在37℃时达到最高。采用Western blotting 对诱导表达的融合蛋白进行验证，诱导表达的融合蛋白能够与抗体发生特异反应，证明表达产物为目的蛋白（图 5-B）。

图 5 pET-TsGPX3 在E.coli BL21（DE3）中表达的SDSPAGE检测（A）和Western blotting 鉴定（B）

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作为生物体抗氧化酶防御体系的关键酶之一，谷胱甘肽过氧化物酶（GPXs）通过多种信号途径在植物响应逆境中发挥重要作用^[15]。本研究获得的盐芥TsGPX3 基因所编码的蛋白含有植物GPXs 蛋白活性中心的3 个保守Cys（C）残基以及植物GPXs 的3 个保守特征结构域，且在3 个保守结构域中均具有3 个GPXs 催化残基Cys⁷⁰（C）、Gln¹⁰¹（Q）和 Trp¹⁵⁹（W），说明本研究获得的TsGPX3 属于植物 GPXs 家族。与其他植物GPX3 进行系统进化分析结果显示，TsGPX3 与同属于十字花科物种的GPX3 亲缘关系最近，而与非十字花科物种的GPX3 亲缘关系较远，说明在进化过程中，不同科属植物物种的GPX3 序列发生了一定的变化。

植物GPXs 家族有多个成员，不同成员的亚细胞定位与其行使的生物学功能相关。采用PSORT 在线分析软件进行盐芥TsGPXs 8 个成员的亚细胞定位分析结果显示，TsGPX1 和TsGPX7 定位在叶绿体中，TsGPX2、TsGPX4、TsGPX5 和TsGPX8 定位在细胞质溶质中，TsGPX6 定位在线粒体中，而TsGPX3 定位在细胞膜和内质网膜上，且具有信号肽^[7]。构建亚细胞定位载体进行亚细胞定位研究表明，盐芥 TsGPX6 主要定位在线粒体和内体中^[16]。本研究通过亚细胞定位研究显示TsGPX3 定位于细胞膜上，与预测基本相符。由于膜上分布众多的载体蛋白、 与细胞活动相关的离子泵、通道蛋白和蛋白受体等，因此推测TsGPX3 对细胞质膜的稳定或控制蛋白转运具有一定的作用^[17]。已有研究显示拟南芥^[14]、 杨树^[5]和百脉根^[6]GPX3 定位在细胞质中，而盐芥 TsGPX3 与其不同，主要定位在细胞膜上，其不同物种的GPX3 亚细胞定位差异可能与抗逆功能有关，有待进一步探究。

大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的原核表达系统^[18]，但融合蛋白在该系统中的表达结果可受多种因素影响，如诱导温度、诱导剂的浓度、 诱导时间等。已有研究显示TsGPX8 的原核表达融合蛋白大小约为23 kD，最佳表达条件为37℃，诱导培养5 h^[19]。本研究构建了TsGPX3 的原核表达载体并进行了原核表达蛋白的分析。前期预测的 TsGPX3 的分子量约为23 kD，将TsGPX8 与His-tag 融合后分子量大约为27 kD，与原核表达电泳图显示的结果一致。采用Western blotting 验证诱导表达的融合蛋白，证明表达产物为目的蛋白。与TsGPX8 原核表达体系的表达条件相似，从本研究实验结果可知，TsGPX3 原核表达体系在37℃，诱导培养5 h具有较高的蛋白表达量。

盐芥TsGPX3 基因的全长cDNA 序列大小为 776 bp，编码一个包含196 个氨基酸的蛋白，具有植物GPXs 的特征结构域。系统进化分析表明，盐芥TsGPX3 与同属于十字花科的萝卜RsGPX3、油菜 BnGPX3 和花椰菜BoGPX3 等同源性较高。亚细胞定位研究显示TsGPX3 主要定位于细胞膜上。TsGPX3 原核表达体系在37℃，诱导培养5 h 具有较高的蛋白表达量。