花生（Arachis hypogaea L.）是我国重要的油料作物和经济作物，发展花生生产对于保障我国粮油安全具有重要意义。花生种植和生产过程中经常受到不利环境因素的影响，例如盐胁迫、高温胁迫等都严重影响花生的产量和品质^{[1, 2, 3]}，干旱胁迫不仅影响花生的产量，而且也容易造成黄曲霉毒素的污染^[1]。越来越多的研究表明，温度诱导的载脂蛋白 （TIL）对于植物响应温度胁迫具有重要的作用。

载脂蛋白广泛存在于动物、植物和微生物中，是一类具有多种功能的胞外分泌小分子蛋白质^{[4, 5]}，最显著的特点是具有3 个保守的SCR（Structurally conserved region）结构域以及由8 条反向平行的折叠片层形成的β 桶状结构^[6]。在植物中，载脂蛋白可以分为温度诱导的载脂蛋白（Temperature induced lipocalins，TILs）和叶绿体载脂蛋白（Chloroplastic lipocalin，CHL）。植物TIL 和CHL 在序列上和哺乳动物的载脂蛋白（Apolipoprotein D）、细菌的载脂蛋白（Lipocalin Blc）和昆虫的Lazarillo protein 蛋白同源^[7]。植物在生长过程中会经常面对低温、高温、 干旱、盐碱等各种不利的环境因素，在受到胁迫后，植物体内一些基因的表达会被诱导，间接或者直接地参与植物的抗逆反应。在拟南芥中，温度诱导的载脂蛋白（TIL）被认为是增加耐热性的必要因子^[8]。 Kawamura 等^[9]发现在低温诱导下拟南芥TIL 蛋白的积累显著增加^[9]，随后的研究进一步表明在拟南芥和水稻中TIL 基因在低温和高温下均上调表达^[10]。 反向遗传学证据表明，当TIL 被敲除后，突变体对除草剂、温度和光照更加敏感，在温度骤然减低、 除草剂处理，或将植物由黑暗环境转移到光照环境下存活率大大降低。相反，过量表达TIL 能够增强拟南芥在冷冻、除草剂和光照胁迫下的适应性^[11]。 最近的研究证实，TIL 蛋白可以通过调节离子的平衡保护叶绿体的稳定，被认为是增加植物耐盐性的重要因子^[12]。叶绿体载脂蛋白基因（CHL）的表达也响应干旱、光照、除草剂、ABA 等胁迫，但对盐胁迫和温度胁迫并不敏感^[13]。TIL 和CHL 在响应逆境胁迫的分工不同，但两者在保护脂质和延长种子寿命上都发挥着重要的功能^[14]。

载脂蛋白最基本的生物学功能是结合并转运脂肪酸、类固醇、信息素、类维生素A 等输水的配体。 越来越多的证据表明，载脂蛋白与植物的环境适应性密切相关。花生在种植和储存过程中，也会面对高温、低温、干旱等自然灾害，但对花生中的温度诱导的载脂蛋白却鲜有研究。本研究以花生栽培品种鲁花14 号为材料，通过构建cDNA 文库和高通量测序，克隆花生AhTIL1 cDNA 的全长序列；进一步获得AhTIL1 的基因组序列及其候选启动子序列，通过生物信息学手段对其候选启动子序列、蛋白结构等进行分析；通过实时定量PCR 等手段对其在不同组织及在冷、热处理下的表达量进行分析，旨为花生TIL 基因的功能鉴定和利用研究奠定基础。

栽培花生品种鲁花14 号、大肠杆菌DH5α 由本实验室保存。高保真Taq 酶购自北京全式金生物公司，RNA 提取试剂、反转录试剂盒、普通Taq 酶、pMD18-T Vector 购自大连TaKaRa 公司；引物由 Invitrogen（上海）贸易有限公司合成；质粒提取和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Sangon（上海）工程技术有限公司；DNA Marker 购自北京天为时代生物有限公司。

收集花生中果针入土10-60 d 的未成熟花生种子，依据 RNAgent 试剂盒（Promega）的方法提取总RNA 和分离纯化mRNA，按pBluescript II cDNA（Stratagene，USA）的试剂盒构建花生种子的cDNA 文库。花生EST 的序列测定采用T3 和T7 通用引物，EST 的常规测序由山东省农业科学院测序中心完成；EST 序列的功能注释通过与已知蛋白进行BlastX 比对完成。

依据花生EST 功能注释结果，挑取与其它植物的TIL 同源的EST 序列进行重新测序，结合与其它物种TIL 基因的序列比对和在线软件ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf）的预测结果确定AhTIL1 的编码区。 根据AhTIL1 的序列设计基因克隆引物pAhTIL1F ： 5'-GAACAACAACAACTACAACAAAA-3' 和pAhTIL1R ：5'-TTTATTTATAACATGGAATAACTCT-3'。将 AhTIL1 的cDNA 序列信息与花生二倍体野生种 Arachis duranensis 和Arachis ipaensis 全基因组序列数据库进行比对（http://peanutbase.org/）。根据AhTIL1 和野生花生基因组比对的结果设计启动子克隆引物ppAhTIL1F ：5'-TGCTAATTTTATTGATTTTG-3' 和 ppAhTIL1R ：5'-GAACATAGAACTTGACCTTGA-3'。 利用CTAB 法提取花生基因组DNA，分别以基因组DNA 和cDNA 为模板进行PCR，条件为：94℃ 3 min ；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1.5 min，31 个循环；72℃ 7 min ；4℃结束反应。PCR 后，用1% 琼脂糖电泳检测结果。切胶回收目的条带DNA，连接到pMD18-T 的克隆载体上进行DNA 序列的测定。

用DNAstar 预测花生AhTIL1 基因编码蛋白质的氨基酸数、分子量、 等电点。用在线软件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/） 分析AhTIL1 的候选启动子的顺式元件。用多序列比对软件 ClustalW 1.83 对AhTIL1 和大豆、苜蓿、拟南芥等植物的TIL 蛋白进行多序列同源比对和进化树分析，输出的文件通过BOXSHADE 3.21 进行着色^[15]。

花生cDNA 芯片的制备和种子不同发育时期的表达谱分析由上海博星公司完成。在试验地中收集花生根、茎、叶、花、 果针和成熟种子，以及花生果针入土后（Date after pegging，DAP）15、25、35、45 和70 d 的花生种子，提取总RNA 进行芯片杂交。以营养钵中生长两个星期、长势比较一致的花生植株为材料，分别用高温（42℃） 和低温（8℃） 处理花生0、3、 6、12 和24 h。分别提取不同处理下花生叶片的总RNA，用PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 合成cDNA，根据AhTIL1 基因的序列设计引物：ahTILRTF ：5'-TCCATTCTTGCCTATCATCCC-3'，ahTILRTR ：5'-CTCCTCATCTAATCGGTTCTGC-3'。 用Actin 基因作为内参，引物为：ahActinF ：5'-GTCATCGTCATCCTCTTCTC- 3'，ahActinR ：5'-CATTCCTGTTCCATTGTCAC- 3'。采用FastStart SYBR Green 试剂盒（Roche）在ABI 7500 荧光定量PCR 仪上进行 PCR 反应，程序为：预变性95℃ 10 min ；95℃ 30 s，59℃ 1 min，35 个循环；测定熔解曲线95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s。每个反应设3 次重复，根据熔解曲线来检测PCR 产物的特异性，基因表达水平的测定使用相对表达，用2^-△△CT 的方法计算。

提取花生总RNA（图 1-A），反转录后构建 cDNA 文库，从cDNA 文库中筛选并克隆到1 个TIL 基因（662 bp），包含一个558 bp 的开放阅读框，将其命名为AhTIL1。AhTIL1 编码186 个氨基酸，其中 59 个为疏水氨基酸。推测AhTIL1 蛋白质的相对分子质量为21.4 kD，等电点为6.78。提取了花生基因组DNA（图 1-B），通过在花生基因组中进行扩增，获得了AhTIL1 基因的基因组序列，长度为790 bp，包含1 个内含子和2 个外显子（图 1-C，图 2）。

图 1 花生AhTIL1 基因的克隆

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图 2 花生AhTIL1 基因组和cDNA 的序列（阴影部分为外显子）

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与其他植物TIL 蛋白的比对结果（ 图 3） 表明，花生AhTIL1 与其它植物的TIL 具有较高的同源性，与番茄的同源性高达86%，与拟南芥AtTIL1 （At5g58070） 的同源性为77%。花生AhTIL1 蛋白的第11-27 位氨基酸为SCRI 区，通过比较发现该区段包含一段非常保守的序列“RYMGRWYEIA”。 SCRII 和SCRIII 的保守性较差，但是分别在各自特异氨基酸“D”和“R”上非常的保守（图 3）。系统进化树结果（图 4）表明，花生AhTIL1 与番茄、烟草、蓖麻等物种中TIL 的亲缘关系较近，与百脉根、 大豆次之。

图 3 花生AhTIL1 与其它植物同源蛋白的序列比对

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图 4 TIL 蛋白的进化树分析

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利用PlantCARE 对候选启动子的预测结果表明，AhTIL1 基因的候选启动子包含ACE、Box4、G-box、 GAG-motif 等与光反应相关的调控元件，候选启动子区域包含与ABA、水杨酸、赤霉素、厌氧等相关的顺式调控元件（表 1）。

表 1 花生AhTIL1 候选启动子元件预测

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花生cDNA 芯片的杂交结果（图 5-A）显示，AhTIL1 在花生根、茎、叶、花和种子中均有表达，在花中的表达量最高，茎中次之，在根中表达量最低，即地上部分（茎、叶、花、果针）的表达量要高于地下部分（根和种子）。芯片杂交检测花生果针入土（Days after pegging，DAP）15、25、35、45 和 75 d AhTIL1 的表达量，结果（图 5-B）显示DAP15 和DAP25 时期mRNA 表达水平最低，在种子成熟的中后期，随着成熟度的增加AhTIL1 的表达也随之增加。在种子成熟后期，种子内脂肪酸等脂类物质的积累增加，载脂蛋白表达量的增加可能与转运和保护脂类物质相关。我们通过RNA-seq 的方法检测了在即将入土果针（S1）、刚刚入土后3 d 左右还未膨大的果针（S2）、入土9 d 左右刚刚膨大的果针（S3） 中AhTIL1 的表达量，结果显示，在S1、S2 和S3 中 AhTIL1 的相对表达水平（RPKM）分别为2.842 77、 0.588 875 和2.198 386。结果表明，在花生果针刚刚入土后，由于光照、机械刺激等因素的影响，AhTIL1 的表达量迅速降低，但随着花生胚胎发育的启动和种子内物质的积累，AhTIL11 的表达量又有所增加。这表明，花生AhTIL1 的表达容易受到光信号的调控，同时也与种子脂质的积累相关。

图 5 花生AhTIL1 在不同组织（A）和种子不同发育时期（B）的表达模式

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用高温（42℃）和低温（8℃）处理花生0、3、 6、12 和24 h，用实时定量PCR 检测AhTIL1 的相对表达量。结果（图 6）表明，AhTIL1 在高温和低温诱导后的表达趋势一致，即在处理3、6、12 和24 h 后其表达量逐渐增加，在48 h 后表达量下降。在高温和低温处理24 h 后，AhTIL1 基因的表达水平分别比对照上调6 倍和3 倍。结果提示，AhTIL1 可能在花生响应高温和冷胁迫过程中发挥着重要的作用。

图 6 花生AhTIL1 在8℃（A）和42℃（B）处理下的表达模式

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随着全球变暖，农业生态环境不稳定，温度、 干旱等非生物胁迫成了制约农作物种植的重要因素。 从植物中挖掘耐逆相关的基因资源，利用这些基因资源提高农作物的抗性是未来分子育种需要解决的问题。温度诱导载脂蛋白最基本的生物学功能是与配体结合，在人、动物和微生物中的研究表明TIL 与细胞膜的稳定性相关^{[16, 17, 18]}。近年来，植物中的 TIL 也陆续被报道。研究结果证实，在受到低温或高温胁迫后，拟南芥、小麦和番茄的TIL 基因均上调表达^{[7, 9]}。拟南芥TIL1-GFP 融合蛋白基因转化洋葱表皮瞬时表达实验表明，拟南芥TIL 蛋白定位在膜上，表明植物TIL 的功能可能也与膜的稳定性相关^[10]。最新的研究表明，TIL 还与保护种子内的脂类物质和延长种子寿命相关^[14]。这些研究表明TIL 可能在植物耐逆机理研究和作物分子育种中具有重要的应用潜力。花生是异源四倍体（AABB，2n= 4x=40）植物，是由两个祖先野生种A. duranensis（A 基因组供体）和A. ipaensis（B 基因组供体）杂交自然加倍的结果^[19]。近年来随着分子生物学和测序技术的发展，花生功能基因组学研究取得了长足的进步，从花生中已经鉴定了大量的抗逆基因^{[20, 21, 22, 23]}。本研究从花生中克隆了花生的载脂蛋白基因AhTIL1 及其候选启动子序列，发现该基因也响应低温和高温的胁迫。

在拟南芥中只有一个TIL 基因，小麦中有TIL1 和TIL2 两个基因，研究发现只有TIL1 响应温度胁迫，在序列上响应温度胁迫的TIL1 和拟南芥的TIL有更高的同源性^[10]。我们从花生中克隆的TIL 基因在序列上与小麦的TIL1 更接近，而且也能响应温度胁迫，因此，本研究将在花生中克隆的载脂蛋白基因命名为AhTIL1。我们的研究还发现，在花生野生种A. duranensis 和A. ipaensis 中均含有1 个温度诱导载脂蛋白同源基因，与鲁花14 号的AhTIL1 的同源性均为97%，仅从编码区序列上很难判断该基因来源于哪一个野生种。然而，有意思的是在候选启动子区域，AhTIL1 与野生种A. ipaensis 100% 匹配，而与A. duranensis 只有60% 的一致性，这表明AhTIL1 可能来源于花生的B 亚基因组。尽管A. duranensis 中同源基因的候选启动子在序列上与AhTIL1 差异很大，但是在候选启动子区域也有与光、ABA 等相关的调控元件，说明TIL 的表达和功能在二倍体祖先种和栽培种中可能具有很高的保守性。另外，在栽培花生鲁花14 号中可能还有一个AhTIL11 的同源基因，这两个基因的同源性可能很高，揭示这两个基因的功能和分化将是我们下一步的工作。

本研究从花生中克隆了响应温度诱导的载脂蛋白基因AhTIL1，分析了该基因的结构和启动子元件，阐明了其在花生不同组织及种子发育不同时期的表达特性，证明该基因能够分别响应高温和低温胁迫。