田间杂草与作物竞争阳光、水分、养分及生长空间，同时又是作物病原菌和害虫的中间寄主生物，严重影响了农作物产量和农产品质量^[1]。同其他作物如水稻、小麦、玉米、大豆和油菜等一样，甘蔗杂草危害也相当严重，使用除草剂除草是目前备受青睐的除草方式。然而传统的除草剂如草铵膦和草甘膦除草无选择性，不能直接用于作物的生长期，因此这个时期的田间除草只能依赖于人工操作^[2]。然而随着中国农村剩余劳动力的减少和劳动力成本的增加，使本来机械化水平就偏低的甘蔗生产成本进一步提高^{[3, 4, 5]}。种植耐除草剂转基因作物是解决这个问题的最有效方法之一，在中国开展耐除草剂转基因育种具有巨大的市场需求^[6]。

2014年，全球种植转基因作物1.815亿hm²，相当于全球总耕种面积的10%，其中具有耐除草剂性状的转基因作物占全球转基因作物面积的61%^{[7, 8]}。开展耐除草剂转基因研究的作物有很多种，得到大面积推广应用的主要以玉米、大豆、油菜和棉花为主^[9]。国内外对甘蔗耐除草剂转基因方面的研究也有一些报道^{[10, 11, 12]}，但对其推广应用还远不如大豆、玉米等其他作物，特别是在国内，甘蔗抗除草剂转基因的研究相对来说还比较落后。

世界上应用得比较多的耐除草剂的基因主要为bar基因和EPSPS基因^{[13, 14]}。本研究通过农杆菌介导法，分别将bar基因和EPSPS基因导入甘蔗中，通过直接喷洒田间施用浓度的草铵膦和草甘膦，以期获得抗草铵膦和草甘膦的转基因甘蔗。

受体材料为甘蔗主栽品种新台糖22号，抗草铵膦的bar基因来源于pCAMBIA3300载体，抗草甘膦的EPSPS基因来源于根癌农杆菌CP4菌株。分别含两个抗除草剂基因的植物表达载体均为本实验构建并保存，转化所用农杆菌菌株为EHA105。所使用草铵膦为浙江永农生物科技有限公司生产，农药名称为“百速顿”，产品批号：2014080701，其有效浓度为20%的草铵膦。所使用草甘膦为江苏丰山集团有限公司生产，农药名称为“双火”，产品批号：2014111201，其有效浓度为41%草甘膦异丙胺盐。

实验地点：农业部转基因植物及植物用微生物环境安全监督检验测试中心（海口） ——文昌基地。

胚性愈伤组织诱导培养基：MS+2，4-D 1 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉胶8 g/L，pH5.8。

胚状体分化培养基：MS+6-BA 1 mg/L+KT 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉胶8 g/L，pH5.8。

生根诱导培养基：MS（大量元素减半，其他成分不变）+NAA 2 mg/L+蔗糖20 g/L+ 椰水100 mL/L+卡拉胶8 g/L+活性炭0.2 g/L，pH 5.8^[15]。

MR培养基：MS（1/5大量元素）+30 g/L蔗糖+100 μm/L乙酰丁香酮，pH5.2。

以田间生长良好的甘蔗顶端生长点处的幼叶组织为外植体，经酒精及升汞消毒、无菌水冲洗后，于无菌滤纸上吸干其表面的水分后，切成1 mm左右厚度的薄片接种于诱导培养基上，于避光条件下进行培养至诱导出愈伤组织。

通过冻融法将含bar基因及EPSPS基因的植物表达载体分别导入到EHA105中。将经PCR鉴定为阳性的农杆菌在含抗生素的YEP平板上划线，挑取单菌落接种到5 mL YEP的液体培养基中，振荡培养至对数生长期，于150 mL三角瓶中扩大培养，培养至OD为0.6左右，将菌液转移到离心管中，5 000 r/min离心5 min，弃上清，吸干残液，用MR液体培养基重悬菌体，最后置于28℃，200 r/min激活2 h，诱导细菌Vir基因的表达，作为转化材料的浸染液。

挑取生长旺盛的愈伤组织于滤纸上吹干使其处于干缩状态，于工程菌液中浸泡30 min后，滤去菌液，用滤纸吸干残液，吹干，转移到MR固体培养基上。共培养3-4 d后，继代筛选培养20 d后，分化筛选培养15 d。待愈伤长出1 cm左右的小苗后，生根筛选培养30 d。

当分别转入抗草铵膦的bar基因及抗草甘膦的EPSPS基因的植株在抗性生根培养基上生长至4-7 cm后，将经PCR鉴定为阳性的转化株系移栽到大花盆里，并置于室外进行种植培养，此次培养得到的植株设为T₀代。到T₀生长8个月左右后，砍去主茎，适量培土进行宿根培养，重新生长出来的植株设为宿根1代。待宿根1代生长到8个月左右，再次砍去所有主茎，再次进行宿根培养，重新生长出来的植株设为宿根2代。而将所砍取的T₀代的甘蔗茎段作为种茎，移栽大田扩繁种植，称为T₁代。

分别合成bar基因及EPSPS基因的特异性引物，分别对T₀代、T₁代、宿根1代及宿根2代的转化植株进行PCR检测，分析bar基因及EPSPS基因在转基因甘蔗中的遗传稳定性。进行PCR扩增检测，扩增时设置正负对照。并对植株扩增产物进行回收测序，检测扩增目的条带的准确性。

对转有bar基因的T₀代、T₁代、宿根1代及宿根2代的转化植株，喷洒田间建议使用浓度4.5/hm²的百速顿草铵膦除草剂（200 g/L草铵膦，永农生物科技有限公司，浙江）。对转有EPSPS基因的T₀、T₁、宿根1代及宿根2代的转化植株，喷洒田间建议使用浓度6 L/hm²的农达草甘膦除草剂（41%草甘膦异丙胺盐，丰山集团有限公司，江苏）。

用合成的bar基因及EPSPS基因的特异性引物，对通过冻融法将含抗草铵膦的bar基因及抗草甘膦的EPSPS基因的两个植物表达载体分别导入EHA105中的农杆菌菌株进行PCR鉴定，并通过农杆菌质粒DNA间接酶切鉴定法进行质粒载体的酶切鉴定^[16]。如图 1所示，1、2号菌株能扩增出与预期条带359 bp大小一致的条带，且如图 2-A所示，通过酶切可以获得与bar基因550 bp大小一致的条带，说明含抗草铵膦的bar基因的植物表达载体已经正确导入到EHA105农杆菌菌株中。同样如图 1所示，3、4号菌株能扩增出与预期条带643 bp大小一致的条带，且如图 2-B所示，通过酶切可以切出与EPSPS基因1 600 bp大小一致的条带，说明含抗草甘膦的EPSPS基因的植物表达载体已经正确导入到EHA105农杆菌菌株中。

图 1 农杆菌菌株PCR 鉴定

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图 2 植物表达载体的酶切鉴定

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通过农杆菌介导法，用含抗草铵膦的bar基因及抗草甘膦的EPSPS基因的两个植物表达载体分别对甘蔗新台糖22号进行遗传转化，结果（图 3）表明，为转化筛选后得到了分别含抗草铵膦的bar基因及抗草甘膦的EPSPS基因的转化植株。

图 3 转含bar 基因（A）EPSPS 基因（B）的甘蔗遗传转化

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当所获得的转化抗性植株生长至4-7 cm，按编号剪取小苗叶片组织约10-20 mg，剪碎置于eppendorf管中，用CTAB法提取DNA。用1.2.5合成的bar基因及EPSPS基因的特异性引物，对分别转有bar基因及EPSPS基因的转化植株进行PCR检测。图 4显示，所检测的转bar基因的23株转化抗性植株中有20株为bar基因阳性（编号为：b1、b2、b3、b5、b6、b7、b8、b9、b10、b12、b13、b14、b15、b17、b18、b19、b20、b21、b22、b23）。而所检测的转EPSPS基因的23株转化抗性植株中有15株为EPSPS基因阳性（编号为：E1、E5、E6、E8、E9、E10、E12、E14、E15、E17、E18、E20、E21、E22、E23）。

图 4 转化bar 基因（A）及EPSPS 基因（B）植株T0 代的PCR 检测

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砍取T₀代为阳性的植株主茎转移到大田扩繁种植，称为T₁代。而T₀代在花盆中留下的蔗头则连续进行两次宿根培养，称为宿根1代及宿根2代。通过bar基因及EPSPS基因的特异性引物，对T₁代、宿根1代及宿根2代进行PCR检测，以检测bar基因及EPSPS基因在转基因甘蔗中的遗传稳定性。图 5显示，T₀代检测为bar基因PCR阳性的20个转化植株，在T₁代、宿根1代及宿根2代中均能检测到bar基因的存在，说明bar基因可以在转基因甘蔗中得到稳定的遗传。图 6则显示，T₀代检测为EPSPS基因PCR阳性的15个转化植株，在T₁代、宿根1代及宿根2代中均能检测到EPSPS基因的存在，说明EPSPS基因也可在转基因甘蔗中得到稳定的遗传。

图 5 转bar 基因甘蔗的遗传稳定性检测

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图 6 转EPSPS 基因甘蔗的遗传稳定性检测

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分别对转bar基因与EPSPS基因的转基因甘蔗T₀代、宿根1代及宿根2代，喷洒田间施用浓度的草铵膦4.5 L/hm²和草甘膦6 L/hm²。转bar基因与EPSPS基因的转基因甘蔗T₀代、宿根1代及宿根2代喷洒除草剂7 d后观察，并拍照。转bar基因甘蔗T₀代、宿根1代及宿根2代喷洒草铵膦7 d后的结果（图 7）显示，每个花盆的左边为补充种植的非转基因对照植株，已经干枯并逐渐死亡，而右边为转bar基因植株则不受草铵膦的任何影响继续健康生长。说明转bar基因的甘蔗T₀代、宿根1代及宿根2代都具备稳定的耐除草铵膦特性。转EPSPS基因甘蔗T₀代、宿根1代及宿根2代喷洒草甘膦7 d后的结果（图 8）显示，每个花盆的右边为补充种植的非转基因对照植株，已经干枯并逐渐死亡，而左边为转EPSPS基因植株则不受草甘膦的任何影响继续健康生长。说明转EPSPS基因的甘蔗T₀代、宿根1代及宿根2代都具备稳定的耐除草甘膦特性。

图 7 转bar 基因甘蔗喷洒草铵膦

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图 8 转EPSPS 基因甘蔗喷洒草甘膦

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分别对转bar基因与EPSPS基因的转基因甘蔗田间扩繁T₁代，喷洒田间施用浓度的草铵膦4.5 L/hm²和草甘膦6 L/hm²。

田间喷洒草铵膦除草剂10 d后的结果（图 9）显示，杂草及非转基因对照甘蔗均枯黄，基本接近死亡，对草铵膦没有任何耐受性（图 9-A）；喷洒了草铵膦的转bar基因的甘蔗不受草铵膦的任何影响继续健康生长（图 9-B），说明转bar基因的甘蔗对草铵膦有极强的耐受性。

田间喷洒草甘膦除草剂10 d后的效果（图 10）显示，杂草及非转基因对照甘蔗均枯黄，基本接近死亡，对草甘膦没有任何耐受性（图 10-A）；喷洒了草甘膦的转EPSPS基因的甘蔗不受草甘膦的任何影响继续健康生长（图 10-B），说明转EPSPS基因的甘蔗对草甘膦有极强的耐受性。

图 9 田间喷洒草铵膦除草剂10 d 后

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图 10 田间喷洒草甘膦除草剂10 d 后

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草甘膦和草铵膦从化学结构上讲都属含磷的氨基酸类除草剂。草甘膦于1974年投入市场，而草铵膦于1986年投入市场。这两种除草剂都是非选择性的灭生性除草剂，这是他们的共同之处，但作用机制却不同。草甘膦为5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSP）抑制剂。草甘膦通过阻碍此酶，从而破坏杂草所必须的芳香族氨基酸的合成，诸如色氨酸、酪氨酸、丙氨酸，导致杂草枯死。而草铵膦则为谷氨酰胺合成酶（GS）抑制剂，通过阻碍该酶的合成而灭杀杂草。目前草甘膦是全球销售市场最高的除草剂，也是全世界销售额第一的农药品种，2012年，其销售额达45.75亿美元。可见，草甘膦的销售与应用远远超过了草铵膦。所以目前抗草甘膦转基因作物的推广应用也最为广泛。

但随着草甘膦抗性难除杂草的增多、百草枯禁用日期临近，草铵膦作为理想的替代选择成为业界关注的热点品种。在2014年11月的草铵膦应用技术与市场推广交流会上，不少业内专家认为，除草剂将进入草铵膦时代。草铵膦对土壤、作物根系和后茬无影响，杀草谱广、持效期较长，可以减少用药次数，降低成本，性价比优势明显，未来应用面积将进一步扩大。国内百草枯水剂退市后，近4万t市场空白将被草铵膦等灭生除草剂替代，而草铵膦将成为唯一的快速灭生除草剂，尤其是浅根作物行间除草，增长空间大。草铵膦生产工艺复杂，要经过13道反应工序，历经半个多月的时间才能生产出来，国内能生产出这一产品的厂家屈指可数，产能供应不足。同时，价格偏高也限制了其在大田作物的应用。虽然草铵膦的用药成本是百草枯的2-3倍，但至少能节约一次用药，每公倾可以节省用工成本300多元钱，目前人工成本贵，而且劳动力紧缺。百草枯的退市，使得灭生性除草剂选择空间变小；现在农户对种植成本有了新的认识，不是简单看价钱，关键看性价比；随着草铵膦规模的不断扩大和科技进步，也会逐渐降低生产成本，这几大因素让草铵膦有非常大的发展潜力。同时这也将进一步推进抗草铵膦转基因作物的研究与应用^[17]。

利用农杆菌介导法分别获得了抗草甘膦与草铵膦的转基因甘蔗，并对T₀代、宿根1代、宿根2代及田间扩繁T₁代外源基因遗传稳定性和耐除草剂稳定性进行较为系统的研究。结果证明，转bar基因耐草铵膦和转EPSPS基因耐草甘膦的甘蔗转基因植株的外源基因均能稳定遗传，耐除草剂特性强且稳定。因此，转bar基因和转EPSPS基因的耐除草剂转基因甘蔗有良好的应用前景。