铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Mi-go），又名黑节草，为兰科石斛属多年生草本植物，主要分布于浙江、云南及陕西等地。铁皮石斛具有极高的药用价值和经济价值，其新鲜茎或干燥茎均可入药，民间有“救命仙草”之美誉，现代药理学研究表明铁皮石斛具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、提高免疫力等诸多功效^[1]。铁皮石斛自然条件下不易萌发，生长极其缓慢^[2]，对生长环境条件要求苛刻。由于长期的过度采集加上生态环境的恶化，铁皮石斛野生资源日趋稀少。为保护这一珍稀物种，近年来国内外广泛开展铁皮石斛组织快繁技术的研究，已确定了通过组织培养培育大量试管苗，发展铁皮石斛人工栽培是解决铁皮石斛资源紧缺问题的有效途径^[3]。

目前铁皮石斛外植体材料选用最为广泛的是种子和茎段。以种子作为外植体，操作简单，增殖系数高，分化能力较强^[4]，但后代性状不稳定易变异。而用茎段为外植体诱导时间短、发生过程简单，能较好地保持母本的生物学性状和经济性状^[5]，但增值系数低、苗存活率低。本研究探讨了不同激素和天然添加物对茎段组培过程中丛生芽的诱导和增殖的影响，并筛选出最佳培养基。

铁皮石斛为浙江雁荡山软杆矮脚品种，由陕西省略阳县秦脉生物科技有限公司提供。

选取长势良好，均匀，叶片繁茂的铁皮石斛当年生幼嫩茎段，流动自来水冲洗10 min后用滤纸擦净。在紫外线照射20 min过的超净工作台上用剪刀将茎段切成长度为1-1.5 cm的带节小茎段，先用75%酒精浸泡1 min，后用0.1%升汞消毒10 min，无菌水冲洗6-7次待用。

将消毒好的茎段接种在添加不同浓度6-BA、NAA和蔗糖的不同处理的MS基本培养基上，进行丛生芽的诱导培养。每个处理接种外植体6瓶，每瓶接种5个茎段，重复3次。培养30 d后统计不定芽的诱导数和诱导率。诱导率（%）=（诱导出不定芽的外植体数/总外植体数）×100%。

根据单因素实验选出每种因素最优浓度，进行L9（3⁴）三因素三水平正交实验设计，实验操作处理同上。

在不定芽诱导培养基中培养60 d后，选取长1-2 cm的不定芽切下，接种到添加不同6-BA和NAA的9种不同处理的MS基本培养基上，进行丛生芽增殖。每个处理接不定芽6瓶，每瓶接种4个芽，重复3次。培养30 d后继代培养，以30 d为一个周期，90 d后统计丛生芽的繁殖系数。

繁殖系数=增殖所得丛生芽的总芽数/接种长出丛生芽的芽数

选取长势均匀一致的丛生芽，接种到附加不同天然添加物的基本培养基，每个处理接种丛生芽2株，每瓶接种10瓶，重复3次。培养30 d后统计芽的株高、增殖芽数和增殖叶数。

实验采用的培养温度为（25±1）℃，光照强度2 000 lx，光照时间为12 h/d。

运用SPSS23.0进行数据方差分析和显著性研究。

生长调节因子植物激素，是植物组织培养中发挥生物学效力最强的培养因素，在植物组织培养中最常用的是生长素和细胞分裂素。本实验选用了其中最具代表性的NAA和BA来研究。在接种茎段后的7-15 d内，不同处理瓶内的茎段开始萌发出细嫩小芽。空白对照率先萌芽，添加激素的处理组略有迟缓，但后期从芽的数目和芽的健壮情况来说都明显优于空白组。如图 1所示，随着BA的加入会先减弱不定芽的诱导，随着浓度增高又明显促进了芽的诱导，当达到2.0 mg/L后其对芽的诱导开始起到抑制作用。如图 2所示，NAA对不定芽诱导的影响是先增大后减小，在0.6-1.0 mg/L浓度范围内表现出显著的促进作用，在0.8 mg/L到达最高点。如图 3所示，蔗糖对不定芽诱导率的影响较为平缓，诱导率维持在一定水平内波动，可以发现30 g/L的蔗糖添加量有最大的促生芽作用。

图 1 BA 浓度对不定芽诱导的影响

图选项

图 2 NAA 浓度对不定芽诱导的影响

图选项

图 3 蔗糖添加量对不定芽诱导的影响

图选项

根据前面单因素实验设计得出每种因素的最佳浓度，设计三因素三水平正交实验，如表 1所示。

表 1 三因素三水平正交试验设计

表选项

以NAA、BA、蔗糖综合作用进行不定芽诱导正交实验，结果（表 2）表明，3种因素以适当比例综合作用比单独使用时不定芽的诱导率要优于任何一种激素单独处理。处理8（NAA 1.0 mg/L+BA 2.0 mg/L+蔗糖26 g/L）达到了86%的最高诱导率（图 4），处理9次之，相比于单一因素有显著的综合促进作用。由表 3方差分析可知，NAA和BA对不定芽的诱导影响显著，且BA要重要于NAA，蔗糖对其影响不显著。综合单因素和正交实验设计，得出不定芽诱导培养基最优配方为：NAA 1.0 mg/L+BA 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L。

表 2 三因素三水平正交试验结果与分析

表选项

图 4 不定芽的诱导

图选项

表 3 三因素三水平正交试验结果的方差分析

表选项

针对丛生芽的增殖，设计了两因素三水平的完全随机实验，增殖的丛生芽如图 5所示。统计结果（表 4）表明，所进行的激素配比都能显示对芽的增殖有促进作用。当NAA在较低浓度时BA浓度的变化对丛生芽增殖的影响无明显区别，随着NAA浓度的提高，BA对丛生芽增殖的影响呈现着先增大后减小的趋势，说明或高过低浓度的BA对芽的增殖有抑制作用。整体来看，NAA对芽增殖的影响随着浓度增高而逐渐开始抑制。选取合适的浓度对芽的增殖有显著的促进作用，其中处理5（图 5-A）最优达到了4.5倍的繁殖系数，茎秆粗壮叶片繁茂丛生芽众多，其次处理1（图 5-B）的繁殖倍数有3.6，表明此激素配比下也有明显的促生长作用。综合来看，得出丛生芽增殖的最优激素配比为：NAA 0.5 mg/L +BA 1.0 mg/L。

图 5 丛生芽的增值

图选项

表 4 两因素三水平完全随机实验结果

表选项

在铁皮石斛的组培快繁中，天然添加物的加入往往会对组培苗的生长造成一定的影响。本次实验中选用了香蕉汁、椰子汁、马铃薯汁和活性炭，结果（表 5）显示，对比空白组，香蕉汁（图 6-a）在株高、增殖芽数和增殖叶数都有一定的升高，尤其是叶片数显著增多，表明香蕉汁对丛生芽的生长有综合性多方面的促进作用，尤其是促进叶的发育。椰汁与空白对照相比无明显的差异，可见椰汁的加入对生长无明显促进或抑制作用。马铃薯汁的加入有效增加了株高和增殖芽数，说明马铃薯汁能促进茎和芽的生长，但对叶的增殖有抑制作用，可能是马铃薯所含的活性物质影响了叶的增殖机制。活性炭的加入（图 6-B）显著促进了丛生芽各项生长指标，可能与吸附代谢废物改善生长环境有关。比较来看，香蕉汁的功能最全面且显著，活性炭可促进丛生芽增殖。从而得出丛生芽增殖的最佳培养基为：NAA 0.5 mg/L + BA 1.0 mg/L +香蕉汁100 g/L +活性炭100 g/L。

表 5 不同天然添加物对丛生芽增殖的影响

表选项

图 6 不同天然添加物对丛生芽增殖的影响

图选项

培养基中生长素与细胞分裂素的浓度及配比对铁皮石斛组织培养中芽的诱导与分化起着决定性的作用，这在本实验中有着明显体现。由实验结果可以看出，单一的NAA或BA在一定浓度内对不定芽的诱导有明显促进作用，过高或过低可能起到抑制作用。在NAA和BA交叉配比的实验结果分析，明显优于单一激素作用，也证明了生长素与细胞分裂素的协同调控作用在组织培养中的重要性。在正交实验过程中发现，诱导率最高的激素配比组诱导出的芽不一定是最为健壮的，诱导率低的处理组长出的芽可能更为健壮，可能是因为同一外植体诱导出的芽越多其吸收的营养物质得到分流越多，影响了长势。要使芽诱导率既高且健壮，可能需研究芽诱导的动力学过程，检测指标也不应是单一的诱导率。另外，进行不定芽诱导的实验中所有处理组都直接诱导出了不定芽，并未出现宋顺等^[6]实验中诱导出原球茎的现象，可能是原球茎的诱导需要更高浓度的BA。

控制细胞分裂素类和生长素类两者的浓度，可以控制芽或根的分化，细胞分裂素/生长素的比值大时有利于芽的形成，比值小时则有利于生根^[7]。本实验也证明了在基本培养基中添加低浓度的NAA、6-BA能促进腋芽诱导和增殖，高浓度的NAA、6-BA不利于腋芽的萌发和分化，选取合适的浓度和配比对组培苗的生长有关键性作用。另外与前人研究出的激素配比^{[8, 9]}不同，可能与选用石斛品种和外界环境控制有关。

天然添加物的加入往往是利用其丰富的营养物质，使组培苗更易能适应于培养基环境，从而达到快速繁殖的目的。本实验发现香蕉汁对丛生芽有显著促生长作用，尤其是叶片增殖上。马铃薯汁对从生芽增殖效果不明显，甚至还会抑制叶片生长。这与蒋林等^[10]的实验结论一致，香蕉泥对石斛芽的增殖和生根壮苗效果突出而土豆泥主要用于壮苗。活性炭的加入有效促进了组培苗生长不褐化，可能与吸附了代谢产生的废物和减弱光照有关。

以茎段为途径建立铁皮石斛快繁体系高效稳定的获得组培苗是可行的。生长素与细胞分裂素的协同调控作用在组织培养中很重要，得到的不定芽诱导最适激素配比为：NAA 1.0 mg/L+BA 2.0 mg/L；丛生芽增殖最适培养基为NAA 0.5 mg/L+BA 1.0 mg/L+香蕉100 g/L+活性炭100 g/L；香蕉汁和活性炭的加入能有效促进组培苗生长。