1987年，Ishino等首先在K12大肠杆菌中发现串联间隔重复序列[1, 2]，2002年，这种序列被命名为成簇的规律间隔性短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）[3]。2005年，根据几个实验室的实验结果推测，CRISPR及其相关蛋白CRISPR-associated protein 9（Cas9）与细菌的免疫机制有关，可以用来识别并降解外来的DNA，抵抗遗传侵入[4, 5, 6]。随后的研究证实了这一推测，CRISPR/Cas9系统作为一种免疫防御机制，在细菌和古细菌基因组中是广泛存在的，可以抵抗侵入的病毒和质粒[7, 8, 9, 10, 11]。
酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes，Sp）来源的II型CRISPR/Cas9系统利用核酸酶Cas9，与两种非编码RNA，即crRNA和tracrRNA来锚定目标DNA[12]。这两种非编码RNA可以进一步简化融合成一段单链引导RNA（single guide RNA，SgRNA）。保守的间隔相邻基序（Proto-spacer adjacent motif，PAM）位于基因组靶点的3'端，是Cas9识别靶点所必需的序列。如果PAM序列前17-20个核苷酸与SgRNA序列相同，那么Cas9/SgRNA复合体可以特异地结合到这段特定序列上。成功结合以后，Cas9的两个独立的核酸酶结构域将在PAM序列前3个碱基处切断DNA双链，留下一个平末端的DNA双链断裂（DNA double stranded break，DSB）。这种DSB可以通过非同源末端侵入（non-homologous end joining，NHEJ）通路修复，也可以通过同源重组（homologous recombination，HR）进行修复[2, 13, 14]。
当作用机制被研究清楚后，科学家们短短几年就将CRISPR/Cas9发展为全世界最热和最有力的基因工程工具，各种研究性文章层出不穷[15, 16, 17, 18, 19]。CRISPR/Cas9成功用于多种植物和动物的基因敲除、基因插入、基因调控、基因修复和文库筛选等，加速了农作物的改良和动物育种，甚至逐渐走向临床应用，有望治疗人类遗传性疾病。然而CRISPR/Cas9并非没有缺点，它也会引起严重的脱靶（Off-target）效应[20, 21, 22]，产生假表型和错误的解释，有时甚至会产生严重的副作用。在应用大文库Cas9载体选择性筛选特定表型的时候尤其需要着重考虑CRISPR/Cas9的脱靶效应，如果一个少见的脱靶突变恰好得到了目的基因突变的表型，就会影响整个试验的准确性。唯一真正有效的验证方法就是对得到的突变体进行全基因组深度测序[23]。显而易见，这对大多数实验室来说花费昂贵，且费时费力。所以在CRISPR/Cas9试验开始之前，利用前人总结的经验、设计原则来提高CRISPR/Cas9特异性，这样才能最大可能获得真正想要的目地突变体，避免脱靶效应的影响。本篇综述仅关注CRISPR/Cas9脱靶效应相关问题，与大家共同探讨。
1 影响Cas9/SgRNA靶点专一性的因素 1.1 PAM序列细菌的种类不同，锚定靶点DNA的PAM序列也有所不同[24, 25]，但所有PAM序列都严格位于靶点序列的3'端，被Cas9的独特结构域所识别[15, 26]。目前应用最广的是酿脓链球菌Cas9（SpCas9），PAM典型序列是NGG，N可以是任何核苷酸，没有差异。可以推测：如果第一位核苷酸明确限制为4种核苷酸中的任何一种，那么Cas9识别的目标就会减少到原来的1/4，明显提高了识别靶点的专一性；如果PAM序列更长一些，变成4位或者5位核苷酸，那么同样可以明显减少Cas9识别的目标序列，使靶点位置更准确。值得注意的是，这种更长的PAM序列提高了靶点的专一性，可以减少脱靶效应，但同时也减少了对于目标序列的可设计靶点数目。
1.2 Cas9/SgRNA的丰度进行体外质粒酶切操作时，如果核酸酶浓度过高，就会产生对质粒的错切。同样可以推测，当Cas9/SgRNA复合体的有效浓度增高时，Cas9切割的专一性就会降低。体外实验也表明，过多的Cas9/SgRNA复合体存在会导致SgRNA错配率的增加[21]。在细胞体内试验中，如果适当减少Cas9和SgRNA质粒转染浓度，靶点的专一性会随之增加[22]。如果增加Cas9蛋白质浓度2.6倍，在全基因组范围，错配数目就会增加2.6倍[23]。在小鼠基因组中，当恒定Cas9蛋白浓度时，SgRNA的丰度就会决定错配数目[27]。由上可见，Cas9/SgRNA的相对丰度可以决定靶点的专一性。任何改变Cas9或者SgRNA表达水平的变化都会影响脱靶数目。
1.3 SgRNA结构对于不同的SgRNA，错配的数目、位置差别非常大。所以，SgRNA除了可以引导Cas9结合到特定靶点，其本身结构也可以影响对靶点的专一性[20, 21, 22, 28]。对SgRNA的3'端结构区进行加长或者缩短修饰，都会改变SgRNA的转录效率或者稳定性，进而改变SgRNA的表达水平[24]。例如，SgRNA发卡结构上有RNA聚合酶III的转录终止信号（4个连续的U-A配对），将最后一个突变为A-U配对，改变了原有的终止信号，从而避免SgRNA转录的过早终止，增加了SgRNA的表达水平；对SgRNA发卡结构长度增加了5 bp，可以改进与Cas9的结合，形成更多有效的Cas9/SgRNA复合体[29]。所以，改变SgRNA结构可以影响SgRNA的表达，以及SgRNA与Cas9的组装效率，从而改变了有效Cas9/SgRNA的丰度，对靶点专一性产生影响。
1.4 SgRNA引导序列的长度通常SgRNA上的引导序列是20个核苷酸，与基因组目标序列PAM前20个核苷酸序列互补形成RNA-DNA双链。然而，并不是增加SgRNA的引导序列长度，就能提高靶点的专一性。例如，将5'引导序列增加到30个核苷酸，结果利用Northern Blot发现延长的5'端在体内被剪切掉[30]。这表明长的SgRNA并不稳定，Cas9蛋白只能保护大约20个核苷酸长度的引导序列。并且，如果SgRNA引导序列被剪短到17-18个核苷酸，那么靶点专一性会得到很大提高，可能因为开始的2-3个核苷酸对与靶点的结合没有帮助，反而能增加与脱靶位点结合的可能性[31]。
1.5 种子区域序列在细菌和哺乳动物中，PAM近端1-12位碱基发生错配就可以导致靶点切割效率的降低甚至消失，所以PAM近端1-12位碱基可以定义为决定Cas9切割效率的种子区域（Seed）[32, 33]。近来试验表明PAM近端1-5位碱基序列可能是更精确的种子区域[27, 34]。尽管不同试验检测到的序列长度有所不同，但是种子区域序列的确可以帮助决定靶点专一性。在哺乳动物基因组中，每个SgRNA有数以万计的与种子区域结合的潜在位点。例如，在小鼠基因组中大约有一百万个AAGGA（种子区域）+NGG（PAM）序列，而只有一万个CGTCG+NGG序列，如果设计SgRNA引导序列时选择丰度更高的AAGGA+NGG，很明显会有更多的结合靶点，那么潜在的脱靶位点也随之增高；如果选择丰度更低的CGTCG+NGG，那么就会有更高的靶点专一性[27]。
1.6 染色质特征的影响此外，基因组DNA并不是简单的、敞开所有空间结构的线性双链DNA。在细胞不同时期，基因组DNA折叠组装成染色质，进一步形成空间结构更复杂的染色体，种子区域+PAM序列被包埋在内部，因此Cas9蛋白与染色质种子区域序列的亲和性（accessibility）也是必须要考虑的问题。更强的染色质亲和性可以让Cas9更容易结合埋在内部的种子区域+PAM序列，有一种Cas9的突变体，dCas9-VP64融合蛋白能够结合染色质空间结构非开放区域序列，并且激活转录[35]。
靶点位置序列的CpG岛甲基化状态也与靶点专一性有关。CpG岛甲基化与染色质沉默相关，更多的甲基化状态可以降低结合力，进而影响靶点的专一性[23]。由此也可以推测，染色质除甲基化的其他表观遗传修饰，如组蛋白乙酰化程度也能影响靶点的专一性。
上面总结的影响Cas9/SgRNA靶点专一性的因素很可能是不完整的和偏差的，很多试验只能发现一小部分的错配位点或预测的假阳性结果，只有多项试验结果结合在一起才可能对影响靶点专一性的因素有更广泛和更深入的理解。例如，染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）方法检测Cas9结合位点，配合全基因组测序可以移除Cas9非依赖性的假阳性（如测序错误和ChIP偏差），获得真实可靠的Cas9靶点。此外，由于靶点特异性高度依赖于目标基因序列，所以小样本数量SgRNA也会引起偏差，这种产生偏差的试验研究所得到的经验规则自然也是有偏差的。但是对于现在这些试验，如ChIP、体外筛选、全基因组测序等，很难扩大试验规模来减少偏差，所以只有利用偏差较少的试验来帮助进行大数量SgRNA的研究[23]。因此发展高效、经济、定量评测脱靶效应的试验技术是目前迫切需要的。利用整合酶缺陷的慢病毒载体（integrase-defective lentiviral vectors，IDLVs）捕获DSB结合测序可能是不错的新方法。Cas9切割可以产生DSB，IDLVs可以通过NHEJ通路整合DSB进而发现全基因组切割位点[36]。同时利用没有Cas9或者SgRNA处理的细胞做严格的对照，可以帮助剔除假阳性。
2 降低脱靶效应的可行性策略 2.1 控制Cas9/SgRNA的丰度如上所述，任何改变Cas9/SgRNA丰度的策略都会影响脱靶效应。典型的Cas9/SgRNA复合体都是通过表达载体瞬时转染细胞得到的，当增加质粒浓度或者用强启动子的时候，增加了Cas9/SgRNA复合体的丰度，增加了对正确靶点的结合效率，但随之脱靶效应也明显增加。如果降低转染的质粒浓度或者使用弱的启动子，就会减少Cas9/SgRNA复合体的丰度，这样就会增加靶点专一性，降低脱靶效应。很明显这也会降低对正确靶点的结合效率。最近，利用RNA聚合酶II转录系统来表达SgRNA，可以更好的控制SgRNA表达量[37]。此外，还可以直接注入重组Cas9蛋白和体外转录的SgRNA，来代替细胞质粒转染表达方法[38, 39]。由于这些外来的Cas9和SgRNA会很快降解，相当于降低了有效Cas9/SgRNA的丰度，这样也可以减少脱靶效应。
2.2 应用单切口酶活性突变体dCas9如果对Cas9切割双链DNA结构域的关键位点进行碱基突变，那么可以获得只能切割一条DNA或者没有切割能力的突变体dCas9蛋白[40, 41]。如果用只有一个切口酶活性的突变体dCas9，配合一个SgRNA切开一条DNA链，然后dCas9再配合另一个SgRNA在相邻区域的互补DNA链中也只切开一个切口，那么两条链上临近的两个切口同样会形成双链断裂，后面的试验可以正常进行。如果一条SgRNA错配，只会形成一个切口，不会形成双链断裂，很快就会被细胞修复正常。而两条SgRNA同时错配，形成双链断裂的脱靶机率很小，这样就极大地提高了靶点专一性。
类似的策略还有利用突变体dCas9与核酸酶FokI形成二聚体来降低脱靶效应。FokI只有在形成二聚体时才会发挥核酸酶活性切割双链DNA[42]，所以融合蛋白dCas9-FokI单体配合两条SgRNA才能完成正确切割。而两条SgRNA在临近区域同时错配的机率很小，所以极大地降低了脱靶效应[43, 44]。
2.3 改变SgRNA的序列改变SgRNA的结构和序列长度，已经被证明是可行的降低脱靶效应的方法。例如，有一些SgRNA的5'端加上GG可以降低脱靶效应[45]。将SgRNA的引导序列截短到17-18个核苷酸，而不是标准的20个核苷酸，在保证一定结合靶点效率的基础上，也可以大大降低脱靶效应[31]。如果不考虑与靶点结合的效率，那么应用这种截短的SgRNA是简易方便的降低脱靶效应的方法。
2.4 新品种Cas9蛋白Cas9蛋白是最早研究和应用最广的Cas9，现在其他菌株中的Cas9也开始被鉴定并应用到基因工程中。利用新菌株中的Cas9替代Cas9蛋白质和改变其蛋白质构象也会提高特异性。由于不同细菌来源的Cas9蛋白质表现出不同的PAM序列[46]，所以影响了对靶点的专一性，通过检测全基因组范围的结合和切割效率，证明新的Cas9蛋白明显提高了靶点专一性。还有通过体外蛋白质工程改变晶体结构，完全有可能设计出新的高特异性的Cas9蛋白。
3 降低脱靶效应的设计工具可以帮助寻找SgRNA潜在脱靶位点的在线工具，见表 1。
对于每个开发出来的设计SgRNA靶点的工具，首要考虑的就是如何在基因组上避免脱靶效应，有些工具对给出的SgRNA还可以提供可能的脱靶位点[22, 47, 48, 49, 51]。通常用脱靶位点的数目，或者评价得分的加权和来评估设计结果的好坏。由于这些工具在具体算法上各自不同，预测出来的脱靶数目和位置结果也有所差异，但在设计序列时都力求最小的脱靶效应。例如，根据靶点位置，有的工具注重考虑在引导过程中的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）和二级结构[49]，对SgRNA选择靶点的影响[53]，或者基因组本身特点如外显子、CpG岛对SgRNA效率的影响[47, 51]；有的工具包含了已有的系统突变研究[22]，或者用户输入惩罚的数据（E-CRISP）[51]，在定位和错配的基础上分别计算脱靶效应；有的工具对脱靶效应的计算采用二进制标准，对整个引导区（Cas-OFFinder）[50]，或者确定的PAM临近和远端区域（CHOPCHOP，CasOT off-Targeter and Cas9 Design）[47, 48, 49]，错配率小于一个具体数值；有时也并不考虑错配的位置和数目，而是用Cas9切割位点的效率来计算和PAM错配[21, 22, 30]。显而易见，每种工具都有自己的优势和特色。需要注意的是，对于研究较少的生物，研究者挑选的设计CRISPR/Cas9靶点工具必须能够接受用户输入基因组信息[48, 49, 50]，可选择替换的PAM[47, 48, 50]，这样才能得到自己的设计结果。
同时，CRISPR/Cas9的试验目的也是一个重要的考虑因素，到底是追求与靶点结合的高效性，还是追求最小的脱靶效应。例如，如果追求的是SgRNA的靶点高效性，不在意脱靶效应，那么可以使用CHOPCHOP这类工具[47]。如果更关注脱靶效应，则需要使用能够定量预测脱靶效应的工具，如CRISPR Design Tool 和E-CRISP[22, 51]，获得最小的脱靶效应。总之，每种工具都有自己的特色，因此在实际设计过程中，可以将几种工具结合使用，得到自己想要的理想结果。
4 展望尽管已有很多研究，但是人们对决定Cas9/SgRNA靶点专一性的重要因素和规则还是了解不够，想要准确预测结合的具体位点还是有难度的。此外，人们对Cas9结合靶点之后的实际功能影响（如切割、突变和转录干扰）之间的关系也研究得不够深入。甚至有些证据表明大多数的Cas9脱靶效应是短暂的，并且对功能的冲击很小。如转录组性能分析表明脱靶效应对基因表达变化的影响可以忽略不计[35, 40, 41]，并且理论计算值表明Cas9结合对随后基因表达的影响呈指数性衰减[54]。面对争议，现在需要的是对全基因组范围的结合、切割和转录组变化的数据进行对比，以此来验证Cas9脱靶效应究竟有多大的影响。
CRISPR/Cas9将在很长的一段时间里作为主流基因工程工具应用到更多的研究领域，现在所用的减少脱靶效应的可行性方法都在一定程度上牺牲了与靶点结合的效率。所以既要保证与靶点结合的效率，又要降低脱靶效应，将是今后CRISPR/Cas9技术研究的一个热点。
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