目前，我国每年约有11-13万人死于原发性肝癌，占全球肝癌死亡数的半数之多。在诱发肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的众多因素中，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染占到50%以上^{[1, 2, 3]}。流行病学和分子生物学研究认为HBV是HBV相关性HCC发生的高危因素。HBx（Hepatitis B virus X protein）是HBV四个开放读码框架中X编码的一种病毒多功能蛋白，研究发现X基因表达产物（HBx）在肝癌形成过程中参与肝癌血管生成，但作用机理并不明确^{[4, 5]}。URG11（up-regulated gene11）是一个可被HBx蛋白上调的基因，能促进肝癌细胞G1期向S期进展，与肿瘤的发生、发展和转移密切相关的基因^{[6, 7]}。

URG11与肿瘤关系的相关的报道已经很多，但并未对其进行详细的生物信息学分析。本实验通过HBx基因稳定转染的HepG2细胞为实验组，非转染的肝癌细胞HepG2为对照组，通过Agilent人全基因芯片筛选差异表达基因，通过生物信息学方法对其进行分析，旨在为HBV相关肝癌的发生、转移的诊断、靶基因治疗和预后评估提供参考。

人肝癌细胞系HepG₂及HepG₂-X均为本实验室保存。10%小牛血清（四季青生物工程工司），RPMI-1640培养基（Gibco公司）；消化液（0.02%EDTA 0.25%胰蛋白酶）；DEPC水；Agilent人类全基因4×44K芯片；Agilent Microarray Scanner和Agilent feature extraction数据分析软件。

用Trizol^[8]法分别抽取实验组及对照组细胞总RNA，紫外分析及电泳检测，合成有荧光标记的cDNA探针并纯化，将基因芯片和杂交探针分别在95℃水溶液中变性5 min，将探针加在芯片上，盖玻片封片，65℃，10 r/min，滚动杂交17 h，实验组和对照组分别杂交上样量825 ng，60℃下用SCC和0.2%SDS分别洗2 min，室温晾干。片结果采用Agilent Microarray Scanner进行扫描，用Feature Extraction software 10.7读取数据，最后采用Gene Spring Software 11.0进行归一化处理，所用的算法为Lowess。

利用BLAST在线分析工具分别对GenBank 的非冗余核算数据库和非冗余蛋白质数据库序列进行比对分析；采用NCBI的ORF finder^[9]对URG11开放阅读框进行预测；利用ExPASy 的ProtParam^[10]程序统计基因中各种氨基酸含量，并预测理论分子量和等电点；应用ProtScale^[11] 程序进行蛋白质的疏水性分析；跨膜结构域分析采用TMHMM软件预测^[12]。信号肽采用SignalP3.0server工具分析^[13]。磷酸化位点分析采用蛋白质亚细胞定位NetPhos2.0 Server在线分析工具^[11]。采用在线工具（http://psort nibb.ac.jp/form.html）预测，通过NCBI数据库GenBank 分析蛋白质保守结构域；采用Protfun在线工具预测URG11的功能分类^[14]；采用同源模型服务软件SWISS-MDEL^{[15, 16]}预测URG11的三维结构；采用MEGA5.0软件进行系统进化树的构建。

本研究利用NCBI ORF Finder对URG11在线分析表明其在+1阅读框有最长的开放性读码框，长度为2 020 bp编码673个氨基酸残基（图 1）。

图 1 人URG11基因序列的ORF分析

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利用NCBIBLAST 工具进行保守区分析，发现URG11氨基酸序列中含有4个保守的作用位点，如图 2所示。

图 2 保守域预测结果

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利用ExPASy 在线工具ProtParam对URG11基因编码产物的理化性质预测结果表明，其中含量最多的两种氨基酸是Cys（C）和Gly（G），所占比例分别为34.4%和27.8%理论分子量为17.06 kD，理论等电点为4.83。

根据蛋白质亲水性/疏水性分析原理，利用ExPASy ProtScal程序，对人URG11基因编码产物的疏水性进行分析，结果（图 3）显示，整条多肽链表现为亲水性，由此可知人URG11是一种可溶性蛋白。

图 3 ProtScal程序分析URG11编码产物的疏水性结果

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图 4 URG11跨膜结构预测产物信号肽预测

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TMHMM综合了跨膜区疏水性、螺旋长度和膜蛋白拓扑学限制等性质，用马氏模型对跨膜区及膜内外区进行整体预测。本实验利用TMHMM对URG11进行跨膜结构的分析，结果表明此蛋白不含跨膜位点。

信号肽（signal peptide）是一段由3-60个氨基酸组成的短肽序列，它是引导新合成蛋白质被输送至目的地点的识别信号，也被称为靶标信号。利用SignalP 3.0 Server工具对人URG11信号肽进行预测，结果（图 5）表明，该蛋白不含信号肽。

图 5 URG11编码产物氨基酸序列信号肽预测

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磷酸化和去磷酸化在多种真核细胞中具有重要的作用，如新陈代谢、细胞分裂及信号转导等，利用NetPhos2.0 Server在线分析工具对URG11磷酸化位点分析，结果（图 6）发现有29个丝氨酸和12个苏氨酸可能被磷酸化。

图 6 NetPhos2.0 Server预测磷酸化位点

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通过Protfun预测URG11编码产物的功能，从分析结果（表 1）可知，URG11具有转录调控、生长因子、信号传导的功能，可能性分别为0.854、0.476、0.365。

表 1 URG11编码产物功能分析结果

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通过Swiss-Modeling软件对URG11的氨基酸序列进行蛋白质三维结构的同源建模，获得其氨基酸序列的预测三级结构（图 7）。

图 7 URG11氨基酸序列高级结构分析结果

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将URG11氨基酸序列与NCBI数据库在核苷酸和蛋白质一级结构水平上进行同源性比较，结果（表 2）表明其在进化中十分保守，与其他12种物种URG11氨基酸水平的相似性为76%-97%。同时也反映了URG11编码产物在不同物种结构上的稳定性对生物体功能的重要性。根据URG11基因特征序列和保守序列在GenBank数据库进行检索，物种间系统进化树（图 8）分析表明，白颊长臂猿、苏门答腊猩猩、猕猴的亲缘关系较近。

表 2 URG11与其他近缘物种该蛋白基因氨基酸序列同源性

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图 8 不同物种URG11编码产物系统发育树

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URG11最早是利用抑制消减杂交及全长PCR扩增技术克隆的一个基因，该基因定位于人11号染色体长臂，能促进肝癌细胞系的增殖、分化并促进肝癌细胞裸鼠体内的成瘤能力，更重要的是将此基因转染入肿瘤细胞，可促进B-连接蛋白（B-catenin）的表达。B-catenin不仅在维持细胞正常形态及介导细胞运动中发挥重要作用，还是与肿瘤发生及发展密切相关的Wnt信号转导通路中的关键分子^{[17, 18]}。Peng 等^[19]发现URG11通过上皮间质转化促进胰腺癌的侵袭，从而导致预后效果不佳。Fan等^[20]发现抑制URG11，HCC细胞可通过下调G1-S期相关蛋白抑制细胞增殖，通过下调BCL-2诱导细胞凋亡。

虽然关于URG11基因的报道已经很多，但并未对其进行详细的生物信息学分析。本研究通过基因芯片技术筛选出HBx参与的乙肝相关性肝细胞性癌差异表达基因URG11，对其同源性比较结果表明，其碱基序列与已经报道的其他12个物种的相似率为76%-97%，与其他物种比较，URG11基因氨基酸序列表现出高度保守性，以保证其执行重要的生物学功能。利用MeGa5.0软件基因NJ法构建系统进化树，人URG11与大猩猩、黑猩猩、普通狨该基因的分子进化距离最近，亲缘关系最密切，这与动物学分类结果一致，这种同源性在一定程度上代表着物种亲缘关系的远近，同时也反映了URG11编码产物在不同物种结构上的稳定性对生物体功能的重要性。随着对URG11结构和功能的深入研究，针对URG11的干扰和抑制可能成为一种新型的临床分子靶点抗癌药物。

本研究结合分子生物学技术和生物信息学分析，通过基因芯片技术筛选出HBx参与的乙肝相关性肝细胞性癌差异表达基因URG11，该基因编码673个氨基酸，预测分子量为17.06 kD，理论等电点为4.83，同源性分析结果表明，其碱基序列与已经报道的其他12个物种的相似率为76%-97%，且符合种属之间的进化关系。亚细胞定位于细胞核的可能性大，具有转录调控、生长因子、信号传导的功能。