羧肽酶G2（carboxypeptidase G2，CPG2）是羧肽酶G家族成员之一，最初是从假单胞菌属（Pseu-domonas）菌株RS-16中分离获得^[1]。羧肽酶G可水解叶酸及其衍生物的C端谷氨酸残基^{[2, 3, 4]}。CPG2在物理特性与动力学特征上与羧肽酶Gl（CPGl）类似，但其对MTX的亲和力要高于CPGl。

CPG2全序列为415个氨基酸，其中包含一个25个氨基酸的信号肽序列和390个氨基酸的成熟蛋白序列。CPG2活性分子为同源二聚体，分子量83 kD-84 kD，催化活性需Zn²⁺。最初CPG2的制备是RS-16发酵而来，表达量仅为200-300 U/L，且CPG2表达量低于菌体总蛋白的0.1%，不能满足研发的需要^{[5, 6]}。因此，用基因工程的方法生产重组羧肽酶G2是另一选择。

CPG2分子无糖基化和二硫键，用原核系统表达是首选。近年CPG2基因已用基因工程的方法表达重组CPG2^{[7, 8]}。在原核系统中表达量最高可占菌体总蛋白的20%^{[7, 9, 10]}。CPG2必须以二聚体形式存在才具有完全的生物学活性^[11]。所以，在大肠杆菌中以可溶形式表达CPG2并能够自发形成二聚体，是大肠杆菌表达CPG2必须考虑的因素。

为了进一步提高CPG2的表达水平，获得有活性的目的蛋白，满足研发的需要，实验通过基因工程的方法在大肠杆菌中高效表达CPG2蛋白，并对其酶学活性进行初步研究，旨在为CPG2的临床应用奠定基础。

Escherichia coli DH5α和BL21（DE3）、表达载体pET-30a为本公司保存。

限制性内切酶、T4 DNA连接酶和Taq酶等购自大连TaKaRa生物工程有限公司；PCR引物由上海Sangon公司合成；PCR产物纯化试剂盒、DNA marker、蛋白质marker、YNB、生物素、酵母粉、蛋白胨、卡那霉素、EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit、鼠抗His单克隆抗体（一抗）、羊抗鼠HRP-IgG（二抗）、牛血清白蛋白（BSA）购自上海Sangon公司；其他化学试剂均为国产或进口分析纯。

根据GenBank登录的CPG2基因序列（登录号：M12599）进行基因合成（上海生工完成）。设计一对扩增CPG2 cDNA的特异性上下游引物，上游引物CPG2-F中引入Bgl Ⅱ酶切位点，下游引物CPG2-R引入NotⅠ酶切位点，引物由上海Sangon合成（表 1）。

表 1 扩增目的基因CPG2的PCR引物

表选项

以人工合成的CPG2为模板，CPG2-F和CPG2-R为引物，PCR扩增该序列，引入Bgl Ⅱ酶切位点、肠激酶切割位点（DDDDK）和Not Ⅰ酶切位点。1%琼脂糖凝胶电泳后，切胶纯化回收。将纯化的目的基因片段与pET-30a Bgl Ⅱ和NotⅠ酶切回收后，16℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，提取质粒后双酶切鉴定，证明目的基因片段已正确插入pET-30a载体；质粒经上海Sangon测序，测序正确的重组质粒命名为pET-30a-CPG2。重组质粒转化BL21（DE3）。

挑取工程菌pET-30a-CPG2/BL21（DE3）接种到20 mL LB（Kan 50 μg/mL）液体培养基中，37℃，250 r/min，培养过夜。次日，按1%的比例接种母液到200 mL LB（Kan 50 μg/mL）液体培养基，37℃，250 r/min培养，OD₆₀₀达到0.6后，加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L，30℃继续诱导表达4 h。将摇瓶置于冰上5 min，5 000×g，4℃，离心5 min收集菌体。

发酵液菌体按1∶5（W/W）悬浮于裂解液（20 mmol/L Tirs-HCl，0.2 mmol/L Zn²⁺，pH8.0）中，超声破壁，8 000 r/min离心5 min收集上清；破菌液上清上样于经0.2 mol/L NiSO₄处理并以20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）平衡的Ni²⁺Chelating Sepharose Fast Flow 鳌合层析介质，分别以50 mmol/L和100 mmol/L咪唑（含20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）洗脱，目的蛋白集中于100 mmol/L咪唑洗脱部分；收集的目的蛋白以截留分子量l0 kD离心超滤管超滤脱盐，置换缓冲为25 mmol/L Tris-HCl（含0.2 mmol/L Zn²⁺，pH8.0），lowry测定蛋白浓度，按每1 mg蛋白加入0.5 U肠激酶（50 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L CaCl₂，0.1% Tween-20，pH8.0）在4℃条件下酶切融合蛋白约16 h；酶切目的蛋白上样于25 mmol/L Tirs-HCl（pH8.5），0.2 mmol/L Zn²⁺平衡的Q-Sepharose Fast Flow（GE Healthcare），用25 mmol/L，Tris-HCl（pH8.5）缓冲液再冲洗5-6个柱床体积后，用50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）洗脱杂蛋白，再以0.1 mol/L Tris-HCl，pH7.5，0.2 mmol/L Zn²⁺一次性洗脱目的蛋白，收集洗脱蛋白峰。SDS-PAGE检测分子量约为42 kD，纯度大于95%。

纯化的带有His标签的融合蛋白经SDS-PAGE分离后电转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭2 h，滴加鼠抗 His一抗（1∶300）（上海生工），4℃孵育过夜，TBST 洗膜3次，再滴加HRP标记的羊抗鼠抗体（1∶1 000）（上海生工），37℃孵育2 h，TBST和PBS各洗膜3次，用滤纸吸干膜表面。利用DAB试剂盒进行显色。

取2.82 mL 0.l mol/L Tris-HCl，pH7.3，0.2 mmol/L ZnCl₂，加入180 μL 1 mmol/L氨甲蝶吟（MTX，中国药品生物制品检定所）。用蒸馏水调零。快速加入50 μL标准品或待测样品（适当稀释，含0.03-0.06 U羧肽酶），混匀，倒入比色杯中于320 nm处测其吸光值，间隔15 s检测一次。记录吸光值变化。

（1）最适酶活反应温度：实验在pH7. 5，反应时间为30 min时分别测定4℃、16℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃及75℃时的酶活。（2）最适酶活反应pH：测定羧肽酶G2酶液在不同pH值的缓冲液中酶活力，确定pH值对羧肽酶G2酶活力的影响。温度为37℃，反应时间为30 min时，分别测定pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0时的酶活性，以确定最佳反应pH值。

以人工合成的CPG2基因序列为模板，PCR法扩增该序列，并引入Bgl Ⅱ和NotⅠ酶切位点及肠激酶酶切位点，回收 DNA 片段长度约1 200 bp。将 Bgl Ⅱ/NotⅠ酶切的PCR产物插入pET-30a，成功构建pET-30a-CPG2原核表达载体，并转化至E. coli DH5α感受态细胞。菌落PCR、质粒酶切图谱（图 1-A）及测序结果显示pET-30a-CPG2重组质粒构建成功。

A：PCR分析BL21（DE3）阳性转化子，其中1：DL5000 DNA marker，2：pET-30a-CPG2/BL21（DE3）cDNA。B：PCR 和限制酶酶切鉴定 pET-30a-CPG2，1：DL5000 DNA marker，2：Bgl Ⅱ 酶切pET-30a-CPG2，3：NotⅠ酶切pET-30a-CPG2，4：Bgl Ⅱ/NotⅠ酶切pET-30a-CPG2 图 1 重组表达质粒pET-30a-CPG2和BL21（DE3）阳性转化子的鉴定

图选项

将pET-30a-CPG2表达载体转入感受态的E. coli BL21（DE3）宿主菌，涂布LB平板，经菌落PCR扩增出1 200 bp片段的菌落为阳性克隆（图 1-A），双酶切重组质粒表明能获得阳性目的片段（图 1-B）。将pET-30a-CPG2/BL21（DE3）经37℃培养的菌液OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.4 mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG），30℃诱导目的蛋白表达，收集菌体，并进行SDS-PAGE检测。结果（图 2）显示，与诱导前相比，IPTG 诱导之后在43 kD附近有一条明显的蛋白条带，与融合蛋白理论分子量相当。菌体经超声波破碎后离心，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。结果（图 2）表明，CPG2以可溶的形式表达。

图 2 CPG2蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达的SDS-PAGE检测 M：蛋白质分子量标准；1：诱导前全菌蛋白；2：诱导后全菌蛋白；3：包涵体；4：破菌上清

图选项

菌体裂解后的上清，经过组氨酸亲和层析和阴离子交换层析，并经Sephadex G-25凝胶过滤层析脱盐、过滤除菌后就得到CPG2蛋白原液。通过该纯化工艺，可以获得纯度大于95%的CPG2蛋白。纯化过程中CPG2蛋白产物的纯度分析（图 3-A），目的蛋白分子量约为42 kD。Western blotting结果（图 3-B）表明，CPG2融合蛋白可与鼠抗His发生特异性反应。

M1：Protein Marker，Mid Range（97-14.4 kD）；M2：低分子量蛋白质Marker Ⅱ（14.4-116kD）；1：出发样；2：穿透峰；3：洗脱峰1；4：洗脱峰2；5：NaOH洗脱；6：出发样（同4纯化样品）；7：穿透峰；8：洗脱峰1；9：洗脱峰2；10：NaOH洗脱；11：CPG2 图 3 融合蛋白CPG2的纯化结果（A）及Western blotting 检测（B）

图选项

用酶动力学方法对CPG2的活性进行了测定，反应体系中最终加入酶量0.1-1.0 U，检测MTX降解率，以计算酶活性。定义37℃条件下1 min内降解1 μmol MTX所需要的酶量为1个活性单位（U）。经检测，CPG2原液比活性为400 U/mg。随着CPG2浓度的上升，MTX的裂解率也随之上升，两者成呈剂量依赖关系（图 4）。

图 4 CPG2剂量-反应曲线

图选项

最适酶活反应温度在pH7.5的条件下、用UV法测定4℃、16℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和75℃下的CPG2的酶活性，通过3次平行试验，取平均值，绘制曲线如图 5。酶的最适温度为37℃，在温度为30℃-40℃范围内，酶活性保持在80%-100%，当温度高于55℃时，酶活性急剧下降至60%，到60℃以后，酶活性急剧下降接近为0。

图 5 温度对羧肽酶G2活性的影响

图选项

在最适温度37℃下用UV法分别测定pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0的缓冲体系下酶活性，通过3次平行试验，取平均值，绘制pH曲线，酶活情况由图 6可见。

图 6 pH对羧肽酶G2活性的影响

图选项

本研究将CPG2连接至原核表达载体pET-30a上，采用 IPTG诱导CPG2融合蛋白的表达。pET-30a原核表达载体具有两个显著特点：一是含有T7启动子，可被宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶识别，T7 RNA 聚合酶的转录效率比大肠杆菌 RNA 聚合酶高5倍，能够高效转录 mRNA，实现融合蛋白的高表达；二是载体上携带His·Tag和S·Tag，诱导表达的 43 kD标签蛋白对目的蛋白的结构及生物学活性影响很小，His·Tag为蛋白纯化提供了亲和位点，而且两者之间有肠激酶酶切位点，便于纯化后将标签蛋白切除^{[12, 13, 14, 15]}。

在蛋白纯化过程中，首先采用 Ni²⁺柱进行亲和层析，之后的SDS-PAGE分析出现43 kD的蛋白条带。重组蛋白的理论等电点pI为6.5，所用缓冲液pH8.0，选择Q柱进行阴离子交换层析，最终获得目的蛋白的纯度大于95%。

羧肽酶G2可水解MTX成无毒的非活性代谢物2，4-二甲基-N10-甲基蝶吟酸（DAMPA）和谷氨酸，两者可以通过肝脏代谢提供一个非肾的MTX清除通道，减轻肾脏毒性^{[16, 17]}。目前，临床上MTX高剂量化疗所致的毒副作用，通常采用亚叶酸钙进行解救。亚叶酸钙与MTX竞争进入细胞、靶组织（骨髓、胃肠道上皮），阻止MTX的作用，补偿DNA合成代谢途径，从而达到缓解HD-MTX引发的不良反应。MTX浓度升高时需要更高浓度的亚叶酸钙，但大剂量亚叶酸钙同样可解救肿瘤细胞，降低抗肿瘤效果。通过水化和碱化尿液增强MTX的水溶性来降低肾毒性，可将毒性影响范围降低到1.5%，但仍会发生因清除延迟而致全身毒性。CPG2是目前被证明用于MTX大剂量治疗的特异性解救药，其可特异迅速裂解MTX，且不透过血-脑屏障（BBB）和细胞膜，因而不会抵消细胞内MTX的作用。MTX裂解产物可在肝代谢，因此CPG2治疗实际上间接提供了一种肝解毒途径^[18]。

CPG2还被用于抗体导向酶-前药疗法（ADEPT）^{[19, 20, 21]}。ADEPT是利用抗体作为载体携带前药的专一性活化酶，选择性地结合于肿瘤部位，使前药可以区域特异性地在肿瘤组织内转化为活性细胞毒分子，起到专一杀伤肿瘤的作用^{[22, 23]}。高纯度的CPG2为上述研究的深入进行提供了可能性。

成功构建了CPG2原核表达体系，并纯化获得了纯度较高的蛋白，初步证明其具有预期的生物学活性。下一步将重点围绕CPG2蛋白的体内外活性开展深入研究。