昆虫质型多角体病毒（cypovirus，CPV）属于呼肠孤病毒科，质型多角体病毒属。根据病毒基因组dsRNA片段在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶中电泳图谱的差异，目前CPV已被分为20个电泳型^{[1, 2]}。马尾松毛虫质型多角体病毒（dendrolimus punctatus cytoplasmic polyhedrosis Virus 1，DpCPV 1）属于1型，该病毒基因组S8片段编码一个由390个氨基酸组成、分子量为43.78 kD的非结构蛋白（p44），是我国的特有种类，于1973年首次分离得到^[3]。

随着结构生物学与信息处理等新技术的运用与发展，包括X射线晶体衍射、低温电镜与三维重构技术，质型多角体病毒结构学研究方面已取得突破性进展^[4]。Yu等^[5]利用低温电子显微镜技术在分辨率上研究了衣壳蛋白的三维结构，在与基因组直接作用的区域中观察到螺旋与β发卡结构之间的构象改变，同时发现了特有的加帽结构和释放通道。Cheng等^[6]通过低温电子显微镜研究发现，CPV的五聚体塔状蛋白的酶区域是拓扑结构高度保守并且有5个连接着鸟苷酰基转移酶和甲基转移酶区域的独特的通道；通过氨基酸序列推理，LPP是由S7片段编码P50蛋白修饰后得到的。Yang等^[7]研究发现：当CPV病毒粒子进行转录时，衣壳蛋白VP1A、VP1B和塔状蛋白VP3构象发生变化，衣壳空间扩大和塔状蛋白周围通道的加宽，使得基因组RNA从紧凑的病毒粒子衣壳更加灵活的转录和输出。

相对CPV结构蛋白的深入研究，CPV非结构蛋白的研究相对缓慢。文力^[8]、张万菊^[9]等对DpCPV 1基因组中的第9片段（S9）的编码序列进行了cDNA克隆和序列测定，并对NS5蛋白的表达和功能进行了初步分析。汪洋等^[10]研究发现由DpCPV基因组第9片段编码的非结构蛋白NS5蛋白在感染昆虫细胞时，定位在昆虫细胞的细胞膜上。段兵^[11]和胡建芳等^[12]对马尾松毛虫CPV基因组第8片段进行序列分析和原核表达。凝胶迁移阻抑分析（EMSA）显示，由CPV基因组第8片段编码的p44蛋白具有序列非特异性的ssRNA结合活性，不与dsRNA、ssDNA、dsDNA结合；进一步研究发现p44氨基酸序列116-197 aa之间的区域（富含谷氨酸区域）为单一的RNA结合区域^[13]。

目前，质型多角体病毒S8片段编码的非结构蛋白p44蛋白的真核表达和昆虫细胞上定位研究还未见报道。本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，构建重组Bacmid-S8-eGFP和Bacmid-S8，将DpCPV 1 S8片段和绿色荧光蛋白基因（eGFP）以C端融合的方式在昆虫Sf9细胞中进行融合表达及细胞定位，旨在为下一步非结构蛋白p44在CPV复制过程中的功能研究提供基础数据。

草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞系Sf9由中国科学院武汉病毒所昆虫病毒基因工程学科组提供，于27℃培养，生长培养基为Grace’s昆虫细胞培养基（10%胎牛血清）。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、BL21和DH10B菌株均为本实验室保存；载体pMD18-T vector系统、T4 DNA Ligase及其buffer购自宝生物工程（大连）有限公司，载体pET-28a、pFastBacDual、pFastBacDual-eGFP（GFP片段插入在PstⅠ和Hind Ⅲ酶切为点之间）和DpCPV 1基因序列S8片段为本实验室保存。

DM2000 DNA Marker 购自康为世纪生物科技有限公司；DNA MarkerⅢ购自东盛生物科技有限公司产；预染蛋白Marker购自南京生兴生物技术公司；异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）购自武汉贝特生物公司；Ni-NTA His.Bind^TM Resins购自Novagen公司；其余药品均为国产分析纯以上。转染试剂lipofectin 购自Invitrogen公司（美国）；荧光染料 Hoechst 33258 购自 Biosharp公司（美国）；PVDF膜购自Millipore公司（美国）；PCR纯化试剂盒购自Promega公司（上海）；质粒提取试剂盒购自Promega公司（上海）。

根据DpCPV 1基因组S8片段的核苷酸序列，设计引物；除通用引物M13F 和M13R（Cat. No. N530-02，Invitrogen公司，美国）外，其余引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物列表，见表 1。

表 1 PCR 扩增产物所需引物列表

表选项

以实验室保存的DpCPV病毒基因组S8为模板，以pTS8F、pTS8R为引物，利用两步法进行RT-PCR扩增^[14]。PCR扩增的片段通过相应的酶切位点酶切，连接到原核表达载体pET-28a（pET28a-S8）。将阳性重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21，1 mmol/L的IPTG于37℃诱导表达4 h。收集菌体，经超声破碎后离心，获得包涵体蛋白。用8 mol/L的尿素溶液溶解包涵体蛋白，然后通过Ni-NTA树脂柱进行蛋白纯化。将收集的洗脱流出液装入透析袋，对含适量甘油的0.01 mol/L PBS pH8.0透析48 h，每4-8 h更换一次PBS溶液。然后，将上述透析袋包埋在聚乙二醇粉末中，对蛋白溶液进行浓缩。并为下一步制备抗体做准备。

纯化的目的蛋白常规方法（淋巴加皮下注射）免疫家兔，制备抗血清。实验兔、鼠饲养，抗原注射及最终采血均委托武汉爱博泰克生物科技有限公司进行。

以pFS8-1F、pFS8-1R和pFS8-2F、pFS8-2R为引物，以pET28a-S8载体为模板进行PCR扩增。将上述胶回收的S8片段分别连接到pFastBacDual和pFastBa-cDual-eGFP载体上。依照质粒提取试剂盒说明书中介绍的方法，分别提取质粒。酶切鉴定阳性克隆子，分别命名为pFastBac-S8和pFastBac-S8-eGFP。

将pFastBac-S8、pFastBac-S8-GFP和pFastBac-Dual空载体（用作对照）分别转座到含有AcBacmid和helper质粒的DH10B感受态细胞，涂布于LA培养基平板[含50 μg/mL卡那霉素（kanamycin，Ka-na），7 μg/mL庆大霉素（gentamicin，Gm），10 μg/mL四环素（tetracycline，Tetra），100 μg/mL 5溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β-D-galactoside，X-gal）和40 μg/mL异丙-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（thiogalactopyranoside，IPTG）]，于37℃培养24-48 h。检查平板上的蓝白斑，白斑即重组Bacmid的菌落。挑取白色单菌落，接种于5 mL LB培养基，37℃振荡培养14 h。取出3 mL于10 000×g 离心10 min，抽提重组Bacmid质粒。抽提Bacmid质粒的具体方法参考Bac-to-Bac^® Baculovirus Expression Systems手册的3.5节。

以上述提取的重组Bacmid为模板，以通用引物M13F和M13R以及目的片段上两端的引物（表 1）进行PCR检测。鉴定正确的重组Bacmid分别命名为Bacmid-p44、Bacmid-p44-eGFP和Bacmid-Dual，于4℃冰箱中保存。

Sf9在35 mm的培养皿中接种5×10⁵的Sf9 细胞，27℃培养过夜。在生物安全柜中弃去上层培养基，加入2 mL无血清的培养基室温放置1 h。取5 μg重组Bacmid质粒以及6 μL脂质体（Invitrogen，美国），分别用无血清培养基稀释至100 μL，将两者混合。静置15-40 min 后，向脂质体和DNA的混合液中加入800 μL培养基，混匀，移入35 mm培养皿中，培养6 h。移去转染液，添加2 mL含10%血清的培养基，混匀，培养72 h后倒置荧光显微镜下观察是否有荧光信号。离心回收上清，即为P1病毒贮液，4℃避光保存。

按照2×10⁶个细胞/孔的量将Sf9细胞转入35 mm的培养皿中，贴壁生长至少1 h。每孔加入适量的上述P1病毒贮液，27℃湿盒孵育72 h。500×g离心5 min取上清，即为P2病毒贮液。重复上述方法扩增P3病毒贮液，用于重组Bacmid的高效表达。

blot 检测 取P3病毒贮液感染Sf9细胞，72 h后将细胞吹起，500×g离心5 min，取适量细胞沉淀，加50 μL的SDS-PAGE上样buffer，进行SDS-PAGE电泳后转膜，以p44蛋白多克隆抗体为一抗，辣根过氧化酶标记的羊抗兔的血清（武汉博士德生物工程有限公司）为二抗，用Western blot法检测p44蛋白的表达。

用P2病毒贮液感染贴壁生长24 h的Sf9细胞（覆盖玻底培养皿50%），27℃培养24 h，移除细胞培养基，用PBS（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na₂HPO₄，2 mmol/L KH₂PO₄，pH7.4）将细胞洗1遍，加入4%多聚甲醛（北京赛驰生物科技有限公司）（过滤除菌）室温静置固定15 min，再用PBS（pH7.4）将细胞洗1遍；加入透化液[0.25% TritonX-100（上海索莱宝生物科技有限公司）]，室温静置10 min；用PBS（pH7.4）洗涤细胞，加荧光染料hoechst 33258染核5-10 min，然后用PBS洗3遍，再加入1 mL PBS。激光共聚焦显微镜（TCS SP2，Leica，德国）观察绿色荧光分布情况。

将DpCPV 1基因组S8片段，放入NCBI上进行Blast序列比对（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。根据已经公开的CPV的S8片段进行比对，利用Mega4.0分析软件进行聚类分析，并采用软件 ClustalW和PHYLIP3.67的邻近法构建系统发育树，其核酸和氨基酸序列比对的bootstrapping数值分别为0.01和0.2。

通过系统发育树分析，DpCPV 1 基因组S8片段与舞毒蛾质型多角体病毒（LdCPV 1）基因组S8片段具有最高的序列同源性（99%），与另外两株DPCPV（AY211092.1和AF389469.1）序列同源性均为98%；分别与3株家蚕质型多角体病毒（BmCPV 1）Strain H、Strain I和Strain suzhou 对应片段的同源性为84%、83%和81%（图 1）。

图 1 DpCPV1 基因组S8 片段的核酸系统发育树

图选项

DpCPV 1 S8片段编码非结构蛋白p44的系统发育树分析显示：p44蛋白与LdCPV 1、BmCPV 1 strain H和冬尺蠖蛾质型多角体病毒（ObCPV 18）的相应非结构蛋白氨基酸序列同源性分别为99%、85%和 35%。另外，我们检测到了p44蛋白与3株鞘脂菌属（Sphingobium）细菌的氨基脱氧分枝酸裂解酶（aminodeoxychorismate lyase）有27%的氨基酸序列同源性（图 2）。

图 2 DpCPV 1 非结构蛋白p44 的系统发育树

图选项

以pTS8F和pTS8R为正反向引物，以DpCPV 1基因组S8片段为模板进行RT-PCR扩增，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段大小约为1 170 bp（图 3-A）。将S8连接至pET28a载体上，构建表达质粒。用BamHⅠ和Hind III双酶切验证正确后（图 3-B），命名为pET28a-S8。经测序，将鉴定正确的克隆质粒pET28a-S8转化大肠杆菌BL21，加IPTG诱导后离心收集菌体，进行SDS-PAGE分析。结果（图 4）显示，检测到插入的S8片段的载体有相应蛋白的表达，蛋白大小约为51 kD。因插入的S8片段后面携带了一个His纯化标签（大小约7 kD），所以实际插入S8片段表达的蛋白大小为44 kD，与p44蛋白大小相符。

M1 ：DL2000 DNA Marker ；1 ：S8 片段RFPCR 产物；M2 ：Marker Ⅲ ；2 ：pET28a-S8 的酶切产物 图 3 S8 原核表达载体的构建

图选项

M ：蛋白Marker ；1 ：BL21-pET28a-S8 ；2 ：经IPTG 诱导的BL21-pET28a-S8 ；3 ：纯化后的目的蛋白 图 4 SDS-PAGE 检测p44 诱导表达结果

图选项

通过His纯化标签经Ni-NTA纯化树脂纯化包涵体的目的蛋白后，所得纯化蛋白免疫家兔，制备p44蛋白的多克隆抗体 anti-p44。

将S8片段克隆至pFastBac-eGFP和pFastBac-Dual质粒上，构建载体。用XhoⅠ和KpnⅠ双酶切验证后，分别命名为pFast-S8和pFast-S8-eGFP（图 5）。分别将pFast-S8、pFast-S8-eGFP和pFastBacDual（空载对照）转座到DH10B感受态细胞，经培养后提取并鉴定正确的Bacmid DNA（图 6）。

M ：DNA Marker 5000 ；1 ：pFast-S8 的双酶切 图 5 酶切验证pFast-S8

图选项

M ：DNA Marker10000 ；1 ：Bac-S8 的PCR 结果 图 6 Bac-S8 的PCR 验证

图选项

用构建的重组Bacmid-S8病毒转染Sf9 细胞，经SDS-PAGE检测蛋白的表达情况（图 7-A）。然后以anti-p44为一抗，HRP标记的羊抗兔血清抗体为二抗，经Western blot检测DpCPV 1 S8编码蛋白p44在昆虫细胞Sf9内表达情况。结果（图 7-B）显示，Bacmid-S8感染的Sf9细胞（第1泳道）在35 kD处有明显条带，而空白的Sf9细胞（第3泳道）和经Bacmid-S7感染的Sf9细胞（第2泳道）作为阴性对照，未检测出条带。第1泳道检测到的条带是p44蛋白的真核表达蛋白，大小为35 kD，但是比原核表达的p44蛋白小了9 kD。

A ：Sf9 细胞碎片的SDS-PAGE 检测；B ：S8 抗体的Western blot 检测；1 ：Bacmid-S8 感染Sf9 细胞收获P2 后的细胞碎片；M ：蛋白Marker ；2 ：Bacmid-S7 感染Sf9 细胞的细胞碎片；3 ：Sf9 细胞 图 7 p44 蛋白的真核表达SDS-PAGE(A)及Western blot(B)检测

图选项

用P3代病毒感染昆虫细胞Sf9后24 h，用激光共聚焦显微镜观察蛋白的亚细胞定位情况。结果表明，昆虫细胞Sf9被杆状病毒感染后，细胞核明显增大，经荧光染料 Hoechst 33258染洗后，紫色部位为细胞核。融合了p44的eGFP的蛋白则主要聚集在细胞质中（图 8-A），而未融合p44的EGFP均匀地分布于整个细胞中（图 8-B），说明S8片段编码的非结构蛋白p44主要定位于细胞质中。

A ：融合p44 的eGFP 的Sf9 细胞；B ：未融合p44 的eGFP 的Sf9 细胞 图 8 融合了EGFP 的p44 在昆虫细胞中的定位

图选项

本研究通过克隆 DpCPV 1基因组S8片段到原核表达载体BL21内，原核表达p44蛋白。经SDS-PAGE电泳检测到诱导表达的蛋白大小约51 kD，这是因为在构建表达S8片段的后面添加了一个His纯化标签，纯化标签的蛋白大小约7 kD，因此DpCPV 1基因组S8片段原核表达蛋白的大小约44 kD，与p44的蛋白大小相符。将DpCPV 1 S8片段原核表达蛋白免疫家兔，制备了p44的多克隆抗体。Western blot结果显示DpCPV 1 S8片段编码的非结构蛋白p44实际大小为44 kD，与推测的蛋白分子量大小结果一致。

采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，将DpCPV 1基因组 S8片段单独插入以及S8片段与绿色荧光蛋白基因（egfp）以C端融合的方式插入苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleocapsid NPV，AcMNPV）基因组中，获得重组的杆状病毒质粒（Bac-S8和Bac-S8-eGFP），转染昆虫细胞Sf9后进行Western blot检测和蛋白的亚细胞定位的观察。Western blot检测结果显示，Bac-S8在昆虫细胞Sf9中获得高效表达，但表达的p44蛋白的大小为35 kD，比原核表达的p44蛋白（44 kD）略小。推测DpCPV 1 S8片段表达的蛋白p44在昆虫细胞内发生了切割修饰，这种蛋白切割现象此前也在DpCPV 1的其它片段表达的蛋白中发现过。如Jin等^[15]将DpCPV 1感染甜菜夜蛾幼虫，取中肠样品经Western blot检测发现，DpCPV 1 S7片段编码的蛋白p50在感染的第3天表达的蛋白大小为50 kD，在感染的第5天发现该蛋白发生切割修饰，修饰后的蛋白大小为31 kD，上述数据证实了DpCPV S7片段在真核细胞内表达的蛋白发生了切割。因此，我们推测p44蛋白在真核细胞内发生了降解或者被昆虫细胞的某些酶切割或修饰。

用激光共聚焦显微镜观察Bac-S8-eGFP的融合蛋白的亚细胞定位发现，融合p44的绿色荧光蛋白（eGFP）主要聚集在细胞质中，没有融合eGFP的分布于整个细胞，说明 DpCPV 1的非结构蛋白p44定位于细胞质中。类似的情况也发生在DpCPV 1 S7片段编码的结构蛋白p50，Jin等^[15]研究发现p50-eGFP同样定位于细胞的细胞质中。而DpCPV 1的S9片段编码的非结构蛋白NS5，免疫荧光实验发现NS5蛋白定位于细胞的细胞质膜上并且跨膜结构域位于蛋白质N端的57-71 aa^[16]。相关蛋白的定位研究发现，为研究病毒的生命周期具有重要作用。

本研究利用Bac-to-Bac系统首次对DpCPV 1 S8片段进行了真核表达和昆虫细胞的亚细胞定位，发现S8片段能够定位到细胞的细胞质。