2.石河子大学动物科技学院，石河子 832003
2. College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832003
基因突变已成为当今生命科学研究的热点之一，其检测方法也随之迅速发展，变性高效液相色谱分析，单链构象异构多态分析技术，毛细管电泳，直接测序，变性梯度凝胶电泳与化学或酶促裂解等突变检测方法中，酶错配切割（ Enzyme mismatch cleavage，EMC）方法临床应用简单，具有一定的优越性。酶错配切割的原理为利用错配分辨酶识别错配，插入和缺失切割错配的DNA，异源双链DNA被识别错配的核酸酶识别并切割成DNA片段[1]，正常DNA和突变DNA在一起通过聚合酶链反应（PCR）变形后再缓慢复性，同时形成同源双链（Homoduplex，HO）和异源双链（Heteroduplex，HE）。EMC中Surveyor 核酸酶是CELI家族成员，对DNA错配部位有高度特异性，识别异源双链DNA中的错配碱基的位置并在错配扭曲链两端的3'处切断，能准确切割异源双链DNA错配位点[2]；T7 Endonuclease I（T7EI）作用于双链 DNA，沿 5'→3'方向催化去除 5'单核苷酸，它既能从 5'末端起始消化，也能从双链 DNA 的切刻或缺口处起始消化异源双链DNA序列[3]。高分辨率熔解曲线分析技术（High resolution melting，HRM）是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速检测出核酸片段中单碱基的突变[4]。HRM技术自2002年应用于基因分型、突变扫描、序列匹配检测以来，受到了高度重视并快速发展。HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速应用在生命科学、医学、农学及畜牧业等领域的研究工作中[5, 6]。
三种检测方法都以变性退火突变和野生型DNA序列，形成扭曲的双螺旋DNA（Distorted duplex DNA）为基础。Surveyor nuclease和T7EI利用核酸内切酶特异性切割扭曲的双螺旋DNA，经电泳显示的DNA条带图谱，确定是否产生突变。并根据酶切电泳获得DNA条带的光密度值，计算确定突变和野生型DNA序列的比率。HRM法是利用扭曲的双螺旋DNA影响饱和染料结合量，荧光信号经高灵敏度信号仪收集后，通过检测荧光信号变化，绘制溶解曲线，通过熔解曲线变化，确定是否存在突变型基因。实验采用3种人工核酸酶生物学活性检测方法确定目标位点是否发生突变（图 1），通过比较分析得出3种检测方法的优缺点，旨在为实验室分析确定细胞利用非同源末端连接修复DNA双链断裂结果提供参考。
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| 图 1 三种检测内源性基因修饰方法的示意图 |
Surveyor nuclease试剂盒（SURVEYOR Mutation Detection For Standard GelElectrophroesis），TRANSG-ENOMI公司；T7EI试剂盒，New England Biolabs公司；LightCycler®480High Resolution Melting Master，Ro-che公司；QuickExtract DNA Extraction solutio1.0（基因组 DNA 快速抽提液），Epicentre公司；Nanophot-ometer微量分光光度计，德国Implen公司；100 bp DNA Marker，北京全式金生物技术有限公司。
1.2 方法 1.2.1 Cas9和TALEN作用靶点确定实验设计Cas9作用于MSTN基因第一外显子，TALEN作用于MSTN基因第三外显子。Cas9和TALENs质粒由广州复能基因有限公司合成（图 2）。
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| 图 2 Cas9（A）和TALEN（B）作用位点及Surveyor、T7E1酶切、HRM引物序列 |
将萨福克绵羊成纤维细胞电转染，采用自己配制的电转液100 µL，CZ-167电转程序，质粒总浓度4 µg，2×106个细胞，电击后37℃静置10 min，加到6孔板内培养，电转3组细胞：Cas9质粒作用于MSTN基因第一外显子；TALEN质粒作用于MSTN基因第三外显子；Pmax绿色荧光蛋白表达质粒作用对照组细胞。培养电转染细胞72 h，收集实验组及对照组细胞。QuickExtract DNA提取液裂解细胞提取细胞基因组，68℃ 15 min；95℃ 8 min处理细胞裂解液，-20℃保存备用。
1.2.3 引物设计通过NCBI查找绵羊MSTN基因全序列（Sequence ID： gb|DQ530260.1|），设计MSTN第一和第三外显子Surveyor 核酸酶、T7E1和HRM检测基因突变的PCR引物（Surveyor nuclease和T7E1引物为SVF/R，HRM引物为HRMF/R）（表 1）。
Surveyor核酸酶和T7EI酶切分析的PCR产物需要高保真热启动酶扩增，保证扩增片段的特异性。TALEN和Cas9靶点周边序列PCR扩增反应体系（表 2）。PCR反应程序：95℃ 3 min；95℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环；72℃ 5 min；4℃保存。琼脂糖凝胶纯化PCR扩增产物，使用Nanopho-tometer微量分光光度计测胶回收产物浓度。
核酸酶酶切PCR纯化产物 由于非同源末端连接（NHEJ）修复机制，经TALEN，Cas9修饰的基因组DNA在TALEN，Cas9靶位点附近的几个碱基序列发生突变。对于Surveyor和T7EI错配检测，首先对PCR扩增产物再一次变性和退火以形成 DNA 异源双链。由于样品中同时存在TALEN，Cas9修饰以及未修饰的DNA，异源双链中可能包括TALEN，Cas9修饰过的DNA的一条链和未修饰的DNA的一条链，也有可能由两个不同的经TALEN，CAS9修饰过的 DNA再退火形成。变性DNA双链经缓慢退火复性形成异源双链。使用400 ng纯化的PCR产物退火处理。PCR产物退火体系20 µL：Herculase II reaction buffer，5×4 µL；PCR纯化产物×（400 ng）；ddH2O补加到20 µL。样品混匀、离心后，进行退火处理。使用以下程序（表 3）进行退火反应。
为了确定CRISPR/Cas9和TALEN的切割效率，用 Surveyor 核酸酶S处理交叉杂交形成的异源双链和同源双链。Surveyor核酸酶S消化体系20 μL：MgCl2 solution，0.15 mol/L 2 µL；Surveyor nuclease S 1 µL；Surveyor enhancer S 1 µL；退火产物16 µL。将PCR管放在42℃水浴锅恒温孵育1 h，然后加入2 µL Stop solution终止消化，储存于-20℃冰箱备用。
1.2.6 T7EI处理PCR胶回收产物400 ng纯化的PCR产物退火处理，样品添加同1.2.5。T7EI核酸酶消化退火产物样品混匀、离心后，进行退火处理同表 4。T7EI核酸酶处理PCR纯化产物20 μL：T7 Endonuclease 0.5 µL；NEBuffer 2 10×0.2 µL；ddH2O 1.3 µL；退火产物18 µL。样品混匀离心后，将PCR管放在37℃水浴锅恒温孵育1 h，-20℃冰箱备用。
8%的PAGE检测Surveyor核酸酶S和T7EI消化退火产物Cas9和TALEN切割效果。Surveyor核酸酶S消化产物加6×Loading buffer 4 µL上样即可，T7EI核酸酶消化产物需要添加EDTA，使其终浓度为45 mmol/L，也可以通过添加6.94 µL的混合物：0.5 mol/L的EDTA与6×xylene cyanol loading dye比例2.45∶4.49[7]。酶切结果使用quantity one定量软件分析。
1.2.8 HRM检测根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分[8]。HRM利用特定的染料可以插入DNA双链中的特性，从而对样品进行检测。基于这种检测原理，HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规PCR基础上增加一个饱和染料，常规PCR后不需电泳等后处理。
按照LightCycler®480High Resolution Melting Mas-ter说明书要求每个样品3份，每份20 µL体系（表 4）混匀后加到96孔板内，LightCycler®480 II型仪器设定相应PCR反应程序，结果使用LightCycler®480基因分型软件1.5版本分析。高分辨率的熔解分析方法分析方便，因为不需要处理步骤和分离步骤[9]。
1.3 非同源末端连接百分比计算公式ƒcut=（Cleavage Band1+Cleavage Band2）/（Uncl-eaved Band+Cleavage Band1+Cleavage Band2）
Cas9和TALEN分别作用于MSTN基因的第一外显子和第三外显子，在作用位点处设计Surveyor，T7EI核酸酶检测以及HRM检测的引物（图 3）。
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| 图 3 PCR扩增Cas9（A）、TALEN（B）作用于MSTN基因示意图 |
电转染9 h细胞换液，72 h荧光显微镜下观察电转染的效率（图 4）。
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| 图 4 Pmax绿色荧光蛋白表达质粒电转染结果图 |
PAGE胶检测Surveyor和T7EI酶切效果，并使用quantity one定量软件分析，定量结果使用非同源末端连接百分比计算公式计算NHEJ百分比（图 5）。
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| 图 5 CRISPR/Cas 9和TALEN的活性酶切鉴定图 |
第一外显子Surveyor和T7EI 检测引物扩增长度为575 bp，Cas9的作用靶点在243-262 bp处，Surveyor和T7EI 在作用靶点发生酶切作用，切开的条带大小为243 bp和313 bp左右，但是在MSTN第一外显子的161 bp处产生一个突变位点，实验将未电转染的萨福克绵羊成纤维细胞和电转染CRISPR/Cas9的细胞提取基因组，分别使用MSTNE1-F/R引物扩增，将其胶回收产物测序，结果均为在161 bp处存在SNP位点（图 6）。Surveyor核酸酶检测到这一突变位点并将其切开，两个突变位点可产生条带大小243 bp和313 bp，161 bp和414 bp左右，但是414 bp这个中间产物中还存在Cas9的突变位点，会产生100 bp和314 bp左右的条带，酶切产生6条带，分别为100 bp，161 bp，243 bp，313 bp，314 bp和414 bp，313 bp和314 bp左右的条带在酶切图上只产生了一条带，所以酶切图上只产生了5条带切开的条带；T7EI只切开了Cas9的酶切位点，产生了两条切开的条带。MSTN第三外显子Surveyor和T7EI 检测引物扩增长度为532 bp，TALEN的作用靶点在239-255 bp处，Surveyor和T7EI在作用靶点发生酶切作用，切开的条带大小为277 bp和293 bp左右。
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| 图 6 MSTN第一外显子基因突变位点测序结果图 |
样品基因型的分析结果见图 7。
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| 图 7 HRM检测Cas9和TALEN基因分型图 |
在基因组编辑技术的推动下，建立动物和细胞模型的速度也越来越快。在这种情况下，基因分型过程成为了新的瓶颈[10, 11]。目前，检测基因靶位点突变的技术主要有Surveyor核酸酶、T7E1分析和高分辨率熔解分析（HRMA）3种，这3种检测方法简单、方便、分析更快，为最常用的检测突变方法。
Surveyor 和T7E1 能有效地切开不匹配的位点，切割的片段大小可提示突变位点的位置，切割产物的数量能够提示突变数量。在设计PCR 引物一般要求在500 bp 左右，目标位点不要设计在中央，酶切产生两条大小不同的条带。Surveyor 和T7EI 酶切的条带可以利用软件分析计算NHEJ 百分比。
电转染的Cas9和TALEN质粒对细胞基因组产生切割作用，则由于Surveyor和T7EI核酸酶对基因组扩增子错配位点的切割作用，会产生较小的条带；若没有对细胞基因组产生切割作用，则会有较大的、完整无缺的基因组扩增条带。阳性对照组只会产生较大的、完整无缺的基因组扩增条带（图 5）。
对于T7EI和Surveyor酶切条带不同的原因分析：对不同的不匹配类型有着不同的切割偏好，T7EI对HE删除和插入位点的偏好要比Survery强；而Survery超越T7EI的优越性是在异位替换和转换[12]。Survery能切割所有类型的不匹配位点，所以有些不是所要的切割位点，Survery也把它切开，另外，Surveyor还对酶切的中间产物有很强的偏好性，100 bp的条带属于酶切的中间产物经Surveyor再次切割产生，因此Surveyor酶切产生了5条带。
HRM的特点是高特异性和高灵敏度，检测灵敏度可以达到1%-0.1%，在大量样本、多个突变位点的筛查上，比传统的非均一性方法更方便、性价比更高[13, 14]。HRM可对任何扩增子上的未知突变进行筛查，不需要识别不同等位形式的引物或探针，不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析。所以，相比定量探针法的突变分析和其他类型的快速突变分析法，应用面大大拓展，操作简便、快速，结果准确，成本也大大降低，成为近年来国外新兴的遗传学、方法学研究和应用热门。
HRM技术在PCR扩增后即可直接被用来对样品进行分析，不需要样品的分离纯化。因而可以降低分离纯化过程中所带来的样品污染的可能性，同时，也能大大减少工作量。HRM技术在PCR扩增时，一定要确保样品混匀，避免饱和染料混合不均，但是HRM技术对硬件的要求严格，对温度分辨率和仪器温度的均一性要求非常高，仪器需要高能量的激发光源以监测熔解曲线的微小变化，这种技术受限于仪器的使用。另外，HRM的引物最好在100-250 bp，扩增片段越小，检测特异性SNP的可能性越大，但是，小片段法也存在明显的缺陷，不能检测所有类型的SNP[15]。HRM技术与Surveyor nuclease 和T7EI相比的缺点是不能得知突变位点的位置也不能能计算NHEJ百分比。
4 结论实验采用了3种检测基因靶位点突变技术HRM、Surveyor nuclease和T7EI核酸酶，3种检测方法的结果都表明作用于绵羊MSTN基因第一外显子和第三外显子的CRISPR/Cas9和TALEN人工核酸酶的生物活性有明显的作用。
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