热激蛋白几乎存在于整个生物界，最早被Ritossa^[1]发现于热激条件下的果蝇幼虫唾液腺染色体中，该染色体呈蓬松状且基因转录水平有所升高。接着Tissieres^[2]利用SDS凝胶电泳技术分离果蝇热激唾液腺得到一组新蛋白，随之命名为热激蛋白（heat shock protein，HSP），又称热休克蛋白。1987年，Soger^[3]对热激蛋白序列、基因结构及作用位点等物理特性的阐明为进一步探究热激蛋白奠定了理论基础。植物热激蛋白发现于1979年，Barnett^[4]对烟草和豌豆组织培养细胞热激处理时，发现植物中同样含有类似于动物体内的热激蛋白。随着Horwit对小分子热激蛋白广泛存在于植物中的认识，人们才给予植物热激蛋白更多关注。

近年研究发现，热激蛋白在高温、干旱、过氧化、重金属等逆境下均能大量表达^[5]，主要通过参与蛋白合成、折叠、细胞定位及蛋白降解等多种生物功能来维持植物内环境的稳定；在调控方面，热激蛋白参与蛋白跨膜运输以及靶蛋白的降解等多种生物功能，其中HSP70可通过抑制端粒酶激活这一信号转导通路来阻止胁迫导致的细胞程序性死亡。因此HSP在植物抵御逆境及适应环境发挥重要作用^[6]。热激蛋白既是植物的必需蛋白，又是应激蛋白，在逆境中有助于细胞结构恢复和机能重建。本文综合阐述了热激蛋白的分类及每一家族蛋白的特征和功能，并初步概述了热激蛋白的作用机理，为深入了解及研究植物热激蛋白提供理论依据。

植物在正常生长及逆境条件下，均能产生分子量为10-200 kD的热激蛋白，Waters等^[7]根据热激蛋白分子量大小分为5大家族，分别为HSP100、HSP90（83-90 kD）、HSP70（66-78 kD）、HSP60（60 kD）和sHSPs（15-42 kD），一般sHSPs是蛋白复合体的小亚基，其复合体的分子量可达200-800 kD。目前，已发现多种热激蛋白，可定位到细胞质及不同细胞器，如细胞核、线粒体、叶绿体和内质网，HSP70蛋白与其他家族热激蛋白有所不同，合成初期存在于细胞质，成熟后迁移到核仁。表 1中HSP70家族的结合蛋白（binding protein，Bip）是细胞内质网应激反应重要部分；HSP60家族的叶绿体分子伴侣（chloroplast chaperonin 60，Cpn60）参与细胞凋亡调控，CCT包含TCP溶质分子伴侣（cytosolic chaperonin-containing TCP-1，CCT），参与应激反应^[5]。

表 1 主要热激蛋白的分布及功能

表选项

HSP100又称为Clp蛋白（caseinolytic protease，Clp），可分为胞质型HSP100和质体型HSP100蛋白，其中胞质型HSP100蛋白只在热激时产生，正常条件下作为非必需蛋白存在。大多数HSP100蛋白是ATP依赖型蛋白酶，具有ATP酶活性和分子伴侣活性，能够与其他蛋白相互作用，协同其他的分子伴侣修复变性蛋白，并降解错误折叠的蛋白^[8]，HSP100作为维护蛋白稳态的参与者首先溶解异常蛋白，然后交给HSP70系统重新折叠加工，最后在HSP60的作用下再次形成具有正常功能的蛋白^[5]。在植物生长过程中HSP100既受生长发育调控，又受热激、寒冷、干旱和高盐等胁迫的诱导^{[9, 10, 11]}，并且参与对植物胁迫应激，番茄LeHSP100/ClpB可能通过降解高温产生的蛋白聚集体从而保护PSⅡ免受高温伤害^[12]。Bowen等^[13]报道，苹果细胞悬浮液经预先热激处理后可增强细胞在致死温度下的存活率，表明HSP100与植物抗逆性密切相关。Grover等^[14]综合报道了转HSP100基因拟南芥、烟草、水稻表现出较强的耐热性，说明HSP100对增强植物耐热能力具有促进作用。

热激蛋白90（HSP90）是真核细胞中最丰富的结构性表达蛋白，约占细胞总蛋白的1%-2%，同时也是应激反应的重要组成部分。从结构上看，HSP90是一个受ATP调节的二聚体分子伴侣，包含3个高度保守的结构域，N端为ATP酶结合结构域，中间段是差异较大的氨基酸区域，C端存在二聚体结合区。未结合ATP时二聚体处于开放状态，当ATP酶活化时，使ATP与HSP90的N端区域结合，构象发生改变，两个分开的N端会短暂联合使HSP90呈闭合状，底物蛋白同时被包裹在HSP90分子夹内，经过ATP水解后两个单体分开并释放出ADP、Pi^[15]。真核生物中所有的HSP90基因都位于细胞核，但蛋白在细胞质、内质网、叶绿体和线粒体中起作用^[16]。

HSP90主要参与蛋白折叠、信号转导、细胞周期调控、蛋白降解和蛋白转运，以及调节拟南芥表型变异等生物过程^{[16, 17]}，HSP90也参与植物发育过程中多个蛋白酶与核甾类激素受体等相关蛋白的折叠与成熟。目前已从植物中分离出细胞质HSP90、内质网HSP90和质体HSP90，与酵母菌、动物的相似度可达63%-71%^[18]。HSP90在拟南芥的遗传进化中起调节作用，对拟南芥形态演变与逆境适应发挥重要作用^[19]，HSP90也参与植物的抗逆过程，豌豆热激蛋白基因GmHSP90s在拟南芥中的过量表达可减轻生物胁迫伤害^[16]。

HSP70又称为热激同源蛋白（heat shock cogna-tes，HSC），是真核细胞中最丰富的热激蛋白之一，也是最保守的家族，根据在细胞中的分布，可分为4大亚族，分别是细胞质、内质网、叶绿体和线粒体HSP70。HSP70蛋白N端包含一个保守的ATPase结构域，C端包括底物结合域（substrates binding domain，SBD）与可帮助SBD与底物结合的C端“lid”^[20]。HSP70作为细胞看家蛋白，以分子伴侣形式防止新生蛋白在成熟过程中不正确聚合和折叠，进而保护植物细胞免受伤害，在植物生长发育与抵抗逆境过程中扮演重要角色。

HSP70家族蛋白的主要作用是：参与新生蛋白的折叠，也可与部分蛋白疏水区结合从而阻止蛋白聚合；参与蛋白的跨膜运输及靶蛋白的降解。HSP70也可通过抑制端粒酶活化的信号转导通路来阻止胁迫下的细胞程序性死亡^[21]。在HSP70行使功能过程中，DnaJ辅伴侣分子的J结构可活化HSP70的ATPase结构域，并把底物传递给HSP70^[22]。拟南芥叶绿体基质HSP70参与芽期种子分化与耐热性的形成^[23]，水稻HSP70在高温下对叶绿体的分化起到重要作用^[24]。HSP70也参与一些特殊功能，例如参与叶绿体的发育，热激蛋白cpHSP70的突变体则表现为子叶杂色、叶片畸形、生长缓慢、根系受损和热敏感^[25]。HSP70还参与多种胁迫应激，菊花HSP70基因在拟南芥的过量表达可增强对热激、干旱、盐胁迫的抗性^[26]，充分说明热激蛋白是植物生长不可缺少的蛋白，在维持蛋白内稳态及植物形态功能发挥重要作用。

HSP60包括原核生物GroEL和真核生物HSP60，具有高度保守性，其中大肠杆菌HSP60呈桶状结构，是由两个环状结构叠加形成的。HSP60可与多种蛋白结合，从而防止蛋白在转录后与折叠前的异常聚集^[27]，HSP60不仅参与二磷酸核酮糖羧化酶（rub-isco）的组装，也参与蛋白的折叠、聚合与装配并转运到叶绿体与线粒体内^[8]。HSP60蛋白进入线粒体并保持线粒体功能，具有抗凋亡作用，也可通过维持线粒体的氧化磷酸化防止细胞死亡^[28]，植物分子伴侣是有限的，一般认为基质分子伴侣HSP70和HSP60也参与新导入叶绿体内蛋白的功能构象的形成。目前对HSP60的研究较少，Tominaga^[29]从孔石菇中分离出UpHSP60基因，其基因的表达受日照、温度和重金属影响，推测HSP60可能参与光照、温度及重金属胁迫应激。

小分子热激蛋白sHSP是一类普遍存在于植物中较为复杂的蛋白，有的植物可包含30多种sHSP，分子量在15-42 kD，也存在分子量为15-22 kD的说法，sHSP可形成分子量为200-800 kD寡聚物。sHSP蛋白序列包括保守的C端结构域和差异性较大的N端，C端大约含有90个氨基酸，又称α-晶体蛋白域（alpha crystallin domain，ACD）；根据N端氨基酸序列及胞内定位可分为6个亚族，其中classI、classII和classIII可定位于细胞质和细胞核，其余3个亚族定位于质体、内质网和线粒体，随着更多的sHSPs被分离，其分类及定位还在不断补充^[30]。

sHSPs通常被称蛋白错误折叠的第一道防线，又称“细胞卫士”^[31]，sHSPs主要通过非极性方式与异常蛋白结合，可以阻止异常蛋白聚集及溶解异常蛋白，但sHSPs本身不参与错误蛋白的再折叠，只是通过分子伴侣与之结合然后经过HSP70/HSP100完成再加工^[30]。sHSPs不仅产生于植物不同生长期^[32]，在高温、寒冷、干旱、盐胁迫等逆境胁迫也会诱导sHSP表达^[33]。拟南芥HSP18.1、HSP17.4和HSP17.6A都与植物抗逆性相关，拟南芥AtHSP15.7基因在正常条件下不表达，但在高温和氧化胁迫下表达量增加^[34]，转sHSP17.7基因水稻在幼苗期表现抗旱作用^[35]。紫花苜蓿线粒体MsHSP23基因在烟草中过量表达可提高转基因植株对砷（Na₂HAsO₄）胁迫的抗性^[36]。

大量文献阐述了HSP的重要性，HSP作为分子伴侣在植物发育生长过程中产生积极作用，从形态、遗传进化、理化性质等方面来看，植物热激蛋白有以下特点^[27]：（1）热激蛋白存在于正常条件下的植物中；（2）同一家族蛋白在不同物种间的相似度较高；（3）不同胁迫对应不同热激蛋白，并且不同胁迫强度下产生相对应量的热激蛋白；（4）热激蛋白作为分子伴侣具有重新折叠变性蛋白、参与从头合成蛋白的终止、阻止蛋白异常聚集的功能。

热激蛋白在植物生长过程中扮演重要角色，HSP既是植物的必需蛋白又是防御蛋白，有助于细胞正常结构的重建和机能的恢复。主要功能如下：（1）分子伴侣功能：参与新生肽链的折叠、蛋白质的组装和转运，并参与从头合成蛋白质的终止^{[37, 38]}；（2）植物发育相关：作为看家蛋白，在植物不同生育期有相当高的含量，能够维持植物正常生长发育；（3）胁迫应激功能：植物体遇到逆境时，通过各种途径减轻胁迫造成的伤害，热激蛋白与异常蛋白的非共价键结合形式使得不影响下游反应；（4）调节信号转导蛋白活性：几个固醇受体必须结合HSP90才能具有结合固醇的活性，HSP90可以阻止信号转导途径中相关的沉默变异基因的表达进而保持正常状态^{[39, 40]}；（5）交叉保护作用：HSP可被多种逆境诱导，不同胁迫下产生的蛋白在某种功能上存在重叠，一种抗逆能力的产生能增强对其他胁迫的忍受性。

在逆境胁迫时主要通过以下几个途径进行防御。（1）维持蛋白的稳定：保护蛋白功能结构、阻止异常蛋白集聚、清除潜在危害的变性蛋白。（2）维护生物膜结构稳定：通过增加膜脂有序性与降低膜脂流动性维护膜的完整性。（3）作为抗氧化剂清除过剩的活性氧（reactive oxygen species，ROS）：ROS水平的升高会导致氧化胁迫，进而造成核酸、蛋白质、碳水化合物和脂质的氧化损伤，热激蛋白可能通过增强葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）的活性而提高谷胱甘肽（glutathione，GSH）的还原水平清除过剩的活性氧^[41]。

热激蛋白作为一类抗逆蛋白，不同家族间存在相互作用，通过构成一个蛋白网络维护其它蛋白的稳态。例如，豌豆HSP18.1可结合热变性蛋白并保持折叠状态，可以进一步与HSP70/HSP100复合体结合并重新折叠蛋白。真菌Paraphaeosphaeria quad-riseptata根部HSP90的抑制剂monocillin I（MON）会导致HSP100与HSP70的表达量升高从而提高转基因拟南芥幼苗的耐热性^[42]。

热激蛋白序列上游存在热应答元件（heat shock element，HSE），可与细胞内热激因子（heat shock factors，HSFs）相互作用调控热激蛋白基因的转录。HSE由真核生物基因上游TATA盒子的回文结合域5'-AGAANNTTCT-3'重复序列形成，通常至少两个HSEs才能发挥作用。HSF序列的N端含有由7个疏水氨基酸重复形成的亮氨酸拉链结构域DBD（DNA binding domain，DBD），DBD可形成螺旋束结构与四股反平行的β片状结构，该结构域保证了HSF与HSE精确定位，以及高度选择性相互作用^[21]，HSF可与多种HSP基因上游的HSE结合调控热激蛋白的表达。

正常条件下，HSF以单体形式与阻遏蛋白结合，而不能与HSE结合，热激条件导致HSF与阻遏蛋白分离，在HSE附近形成三聚体并与HSE特异结合，促进HSP基因转录起始。非胁迫条件下HSP70与HSF相互作用保持HSF的非活性状态，热激时，异常蛋白与HSP70 竞争结合HSF，解除了抑制的HSF可形成具有DNA 结合活性的三聚体，可与HSE结合并启动HSP基因的转录^[43]。信号分子ABA、乙烯、H₂O₂和水杨酸（SA）可能参与高温应激反应^[44]，在豌豆叶片发现热激条件下SA表达量增加，SA会提高质膜 H⁺-ATP酶转录水平和蛋白酶表达水平，进一步引起Ca²⁺和HSP的累积。其中Ca²⁺和钙调素（CaM）也可能参与热激蛋白的表达调控，外源刺激促使细胞内钙调素的量增大，大量的Ca²⁺进一步激活HSF活性并促进HSPs的合成^[45]。也有学者认为热激因子通常以无活性的泛素化形式存在，热激导致泛素化酶失活，使转录因子恢复活性并积累进一步启动热激基因的转录功能^[45]。

热激转录因子可作为热应激基因、热激蛋白以及分子伴侣表达的调控基因，目前发现的热激因子大多集中在番茄与拟南芥中，如番茄中的HsfA1a、HsfA2和HsfB1；在拟南芥中发现了大约25种Hsf同系物，这些Hsfs构成了一个复杂的调控网络，其中HsfA1由H₂O₂、盐、甘露醇诱导产生，HsfA1a与HsfA1b可以调控热激蛋白基因的表达。AtHsfA2对热激基因的转录及耐热性的延伸具有重要作用^[46]。Li等^[47]发现HsfA2序列C端315位赖氨酸的泛素化导致HSP合成受阻与耐热性的下降。

热激蛋白作为植物的基础蛋白与应激蛋白在恶劣的条件下起调节作用，这对植物的发育及进化具有重要作用。总之，植物胁迫应激是一个复杂过程，目前已有大量文献报道热激蛋白，一些文章报道了多种胁迫可诱导产生热激蛋白，主要通过阻止蛋白错误折叠和异常聚集保持内环境的稳态，因此认为热激蛋白具有分子伴侣功能，热激蛋白质的多样化也反映了植物对不同逆境的耐受作用。随着分子生物技术的不断进步，基因组学与蛋白组学的研究方法被广泛应用，分别从热激蛋白DNA、RNA和蛋白质水平进行了深入的研究。另外，一些文献报道通过分子生物学与生物化学等手段对热激蛋白进行基因克隆、蛋白序列分析及蛋白表达等研究发现，热激蛋白在一些反应中具有相关作用或是反应的一部分^[27]。

对热激蛋白的研究可使人们更全面地认识热激蛋白并探索其作用机理，为今后植物抗逆遗传育种和植物进化变异在实际应用中提供更详实的资料。现阶段在对热激蛋白了解的基础上，可以应用于以下研究及实践生产中：（1）通过超表达方式提高植物中HSP及HSF的表达量以增强抗逆能力，同时还可以利用热激蛋白的交叉保护作用提高植物对多种胁迫的抗逆性；（2）热激蛋白可能与种子胚发育、休眠、萌发形成与寿命维持存在密切关系，所以热激蛋白可以应用到种子生产中；（3）热激蛋白对细胞程序性死亡具有抑制作用，进而应用到植物的保鲜及生长期的延长工程中，继而取代激素及农药；（4）热激蛋白在植物进化过程中起生物调节作用，可以为植物进化研究提供重要信息；（5）在环境监测中，以植物热激蛋白对环境的敏感性作为生物标记检测气候变化及环境污染。