2. 西安交通大学前沿科学技术研究院 骨骼关节疾病与治疗研究中心，西安 710061 ；
3. 中国科学院微生物研究所，北京100101 ；
4. 中国科学院上海药物研究所 药物安全性评价中心，上海 201203
2. Bone and Joints Research Center，Frontier Institute of Science and Technology，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061 ；
3. Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101 ；
4. Center for Drug Safety Evaluation and Research，Shanghai Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201203
1966年，Friedenstein等[1, 2, 3]首次从大鼠骨髓中分离鉴定出具有造血支持功能的干细胞，并证明其在体外可以分化为骨细胞及脂肪细胞。在此基础上，Owen及其同事提出间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）这一概念[4, 5]。目前，已经证实MSCs是中胚层来源的一类多能干细胞，具有自我更新及多向分化潜能，广泛存在于胎儿和成体多种组织器官中，例如：骨髓、脂肪、羊水、骨骼肌、胎肺、胎肝、脐血、脐带和胎盘等[6, 7, 8, 9, 10, 11]。其中，骨髓中的含量高，分离及获取操作简便，可于自身获取等特点一直深受研究人员的青睐，因此骨髓来源的MSCs研究比较普遍；但是，目前绒山羊骨髓MSCs体外分离培养的文献报道极少。
绒山羊作为经济价值很高的家畜，有关其生物学研究对当代畜牧业发展具有重大的战略意义。目前的绒山羊转基因克隆大多使用的是成纤维细胞，它的一个显著的缺点是培养传代数目有限、基因转染后存活率低，这一缺点已成为绒山羊转基因新品种培育的瓶颈。本研究从阿尔巴斯绒山羊骨髓中分离培养MSCs，并对其生物学特性进行系统研究，旨在深入了解大型偶蹄类动物骨髓MSCs的生物学特性，为后续转基因动物新品种培育及组织工程提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物阿尔巴斯绒山羊3-5月龄流产胎儿5个。
1.1.2 主要试剂DMEM/F12、IMDM、胎牛血清（Hyclone公司产品）；胰酶、L-谷氨酰胺、地塞米松、吲哚美辛、β-磷酸甘油、维生素C、黄嘌呤、Giemsa染液、DAPI染液（Sigma公司产品）；油红O（上海紫一试剂厂）；转化生长因子-β、人碱性成纤维细胞生长因子、人表皮生长因子（Pepro Tech公司产品）；阿利新蓝染液（阿拉丁公司产品）；氨水（永大公司产品）；CCK-8试剂盒（Beyotime公司产品）；TRLzol 裂解液（Ambion公司产品）；反转录试剂盒（TaKaRa公司产品）；兔多克隆抗体 CD13、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD106和CD166（博士德产品）；山羊抗兔 FITC-IgG（Protein Tech产品）；定量PCR引物均由大连宝生物（TaKaRa）公司设计并合成，序列见表 1。
无菌条件下取阿尔巴斯绒山羊3-5月龄流产胎儿腿骨，用培养基冲洗获取骨髓，加入肝素抗凝。置20 mL DMEM/F12培养基中，1 000 r/min离心10 min，收集细胞；再加入完全培养基（含有DMEM/F12，50 ng/mL人表皮生长因子，10 ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子，10-8 mol/L地塞米松，2 mmol/L谷氨酰胺，5%胎牛血清，100 U/mL青霉素/链霉素），将细胞悬浮后接种到10 mm培养皿中，随后置于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养，48 h后全量换液，以后每隔2 d换液，当细胞生长至80%融合时用0.25%胰蛋白酶进行1∶2的消化传代。培养的过程中，倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长状况。
1.2.2 细胞增殖能力检测取分离至3个不同个体的处于对数生长期的第4代gBM-MSCs，加入完全培养基稀释为2×104/mL细胞悬液，按每孔100 μL接种到96孔板中，每隔2 d换液；接种后的第1天起，每隔24 h加入10 μL CCK-8试剂，置于37℃恒温箱中孵育4 h，用酶标仪检测450 nm处的吸光值，连续检测7 d，并用GraphPad Prism 5软件进行数据处理。
1.2.3 细胞核型分析取第15代处于对数生长期的gBM-MSCs，加入80 μL 0.1 mg/mL秋水仙素，置37℃恒温培养箱中孵育3.5 h；消化收集细胞，加入8 mL 0.075 mol/L KCl低渗液，置于37℃水浴锅，孵育30 min，固定，滴片；Gimesa染色15 min，自来水冲洗，自然晾干，油镜下观察细胞中期染色体形态及数目，并用Genus软件分析。
1.2.4 免疫荧光法检测细胞表面标志物CD13、CD-29、CD44、CD90和CD106取第4代gBM-MSCs，在6孔板内进行细胞爬片，细胞生长至80%融合时，每孔加入1.5 mL 4%多聚甲醛固定30 min；加入封闭液（PBS+2%牛血清蛋白+2%山羊封闭血清+2%脱脂奶粉+0.15 mol/L甘氨酸）室温封闭2 h；滴加1∶200稀释兔多克隆抗体CD13、CD29、CD44、CD106、CD90，4℃孵育过夜，PBS冲洗；之后加入1∶50稀释异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗兔IgG，室温孵育2 h；DAPI染色15 min后共聚焦显微镜下观察结果。阴性对照以磷酸盐缓冲液（PBS）代替第一抗体。
1.2.5 流式细胞术检测细胞表面标志物CD34、CD45和CD166消化收集第4代gBM-MSCs，用F-PBS（含1%胎牛血清PBS）重悬，将细胞以106个/管分装至2 mL离心管中，离心弃上清，分别加 5 μL兔多克隆抗体 CD34、CD45和CD166，避光常温孵育2 h，PBS冲洗，之后加入1∶50稀释异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗兔IgG，室温孵育2 h；补加F-PBS冲洗2次，离心弃上清，加800 μL 2%多聚甲醛固定，流式细胞仪检测，用FlowJo 7.6.1软件分析数据。
1.2.6 多向分化潜能检测消化收集第4代gBM-MSCs，加完全培养基，将细胞浓度调整至2×104个/mL，接种于六孔板中，培养24 h后，更换诱导培养液，以后每隔2 d换液，第21天检测诱导结果。对于成脂肪诱导的细胞，用1%油红O染色，倒置荧光显微镜观察脂滴形成情况；用RT-PCR法检测脂肪细胞经典基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ PPARG（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma）的表达。成骨诱导的细胞，用20 ng/mL硝酸银染色，观察钙盐沉积情况；用RT-PCR法检测骨细胞经典基因骨钙素蛋白GLA（Galactosidase alpha）的表达。成软骨诱导的细胞，用1%阿利新蓝染色，观察酸性黏多糖合成情况，用RT-PCR法检测软骨细胞经典基因光蛋白聚糖LUM（lumican）的表达。
成脂肪诱导液：IMDM，5%牛胎血清，1 μmol/L地塞米松，5 μg/mL胰岛素，0.5 mmol/L黄嘌呤，60 μmol/L吲哚美辛；成骨诱导液：IMDM，5%牛胎血清，0.1 μmol/L地塞米松，0.05 mmol/L维生素C，10 mmol/L β-甘油磷酸；成软骨诱导液：IMDM，5%牛胎血清，10 ng/mL 转化生长因子-β，10-7 mol/L地塞米松，50 μg/mL维生素C。
1.2.7 多向分化相关基因动态表达分析按照上述1.2.6中的实验方法诱导培养gBM-MSCs后，分别提取诱导7、14和21 d 后的细胞总RNA，通过荧光定量PCR法检测诱导不同天数后相应分化基因动态表达情况。对于成脂肪诱导的细胞，检测脂肪经典基因PPARG的表达趋势；对于成骨诱导的细胞，检测骨经典基因GLA的表达趋势；对于成软骨诱导的细胞，检测软骨经典基因LUM的表达趋势；以未诱导的gBM-MSCs作为对照，基因相对表达量用GAPDH标准化并用 2-ΔΔCt 法运算。
2 结果 2.1 细胞分离和培养实验对5个绒山羊流产胎儿进行了骨髓分离培养，获得了5株gBM-MSCs。gBM-MSCs原代培养时4-6 h开始贴壁，大约培养14 d后达到80% 汇合，通过培养基筛选和传代培养去除其他类型的干细胞和终末分化细胞，传至P5时呈现均一的成纤维样细胞，贴壁生长，状态良好（图 1）。
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| A ：第5 代gBM-MSCs ；B ：第15 代gBM-MSCs 图 1 阿尔巴斯绒山羊骨髓间充质干细胞形态 |
第5代gBM-MSCs生长曲线呈S型（图 2），接种后第0-1天为潜伏适应期，从第1天起快速增殖，进入对数生长期，第5天进入平台期，平台期持续1-2 d，之后细胞增殖速度显著下降，进入衰退期。
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| 不同样本代表来自不同个体的gBM-MSCs 图 2 第5 代阿尔巴斯绒山羊骨髓间充质干细胞生长曲线 |
为验证本实验所分离出的gBM-MSCs在体外传代过程中细胞染色体数目是否完整，我们收集第15代gBM-MSCs做染色体数目分析，随机选取20个样本进行染色体计数。结果（图 3）显示，所做的第15代gBM-MSCs中有95%（19/20）的细胞染色体为2n=60条，具有正常二倍体核型，表明体外培养的gBM-MSCs能够进行正常染色体复制和分裂。
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| A ：通过软件处理后去掉底色的核型图；B ：经过配对的核型图 图 3 第15 代阿尔巴斯绒山羊骨髓间充质干细胞核型（2n=60） |
免疫荧光检测结果显示，第5代gBM-MSCs表达间质系表面标志物CD13（图 4-B）、整合素家族成员CD29（图 4-C）、黏附分子CD44（图 4-D）、CD106（图 4-E）及CD90（图 4-F）。
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| A ：阴性对照；B-F ：gBM-MSCs 均表达间质系表面标志物CD13（B）、CD29 （C）、CD44（D）、CD106（E）和CD90（F） 图 4 免疫荧光法检测第5 代阿尔巴斯绒山羊骨髓间充质干细胞表面标志物 |
流式细胞术检测结果显示，第5代gBM-MSCs表达粘附分子CD166（图 5-A）、不表达造血干细胞表面标志物CD34（图 5-B）、CD45（图 5-C）。
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| A ：gBM-MSCs 表达CD166 ；B ：gBM-MSCs 不表达造血干细胞表面标志物CD34 ；C ：gBM-MSCs 不表达造血干细胞表面标志物CD45，蓝色曲线代表实验组样本，红色曲线代表同型对照 图 5 流式细胞术检测第5 代阿尔巴斯绒山羊骨髓间充质干细胞表面标志物 |
第5代gBM-MSCs分别用成脂肪、成骨和成软骨培养基诱导21 d后，进行染色和RT-PCR法鉴定。结果（图 6）显示，成脂肪诱导后细胞质中形成脂肪颗粒，经油红O染色后，能观察到桔红色的脂滴（图 6-A1），RT-PCR显示成脂肪诱导后的细胞阳性表达脂肪经典基因PPARG（图 6-A3）；成骨诱导后细胞质中出现钙盐沉积，硝酸银染色呈阳性（图 6B1），RT-PCR显示成骨诱导后的细胞阳性表达成骨经典基因GLA（图 6-B3）；成软骨诱导后细胞质中形成酸性黏多糖，经阿尔新兰染色后，能特异性着蓝色（图 6-C1）；RT-PCR显示成软骨诱导后的细胞阳性表达软骨经典基因LUM（图 6-C3）。以上结果显示，gBM-MSCs具有多向分化潜能。
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| A1 ：脂肪诱导实验组；A2 ：脂肪诱导对照组；A3 ：RT-PCR 检测脂肪细胞经典基因PPARG 表达。B1 ：成骨诱导实验组；B2 ：成骨诱导对照组；B3 ：RT-PCR 检测骨细胞经典基因GLA 表达。C1 ：软骨诱导实验组；C2 ：软骨诱导对照组；C3 ：RT-PCR 检测软骨细胞经典基因LUM 表达。（GAPDH ：内参；CTRL ：阴性对照） 图 6 体外诱导第5 代阿尔巴斯绒山羊骨髓间充质干细胞向脂肪、成骨和软骨细胞分化 |
进一步通过荧光定量PCR法检测诱导7、14和21 d后相关分化基因动态表达情况，结果（图 7）显示，成脂肪细胞诱导后脂肪经典基因PPARG表达量随着诱导天数的增加逐步上升，诱导21 d后达到最高，约上调1 270倍（图 7-A）；成骨细胞诱导后骨细胞经典基因GLA的表达也随着诱导天数的增加逐步上调，诱导21 d后达到最高，约上调165倍（图 7-B）；成软骨细胞诱导后软骨经典基因LUM的表达量也逐步增加，诱导21 d后达到最高，约上调63倍（图 7-C）。本实验进一步证实我们分离培养的gBM-MSCs具有多向分化潜能，多向分化相关基因的表达水平随着诱导天数的增加呈上升趋势。
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| A ：成脂肪细胞诱导后脂肪经典基因PPARG 的表达；B ：成骨细胞诱导后成骨经典基因GLA 的表达；C ：成软骨细胞诱导后软骨经典基因LUM 的表达 图 7 实时定量PCR 法检测诱导后分化相关基因的动态表达 |
本研究采用全骨髓贴壁培养法，对5个绒山羊流产胎儿进行了骨髓分离培养，用含人表皮生长因子（EGF）和人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等的扩增培养基培养，获得了5株细胞，该细胞具备MSCs的生物学特征。有研究证实，培养基中添加人碱性成纤维细胞生长因子有利于细胞贴壁生长[12]，同时不影响其多向分化能力[13]；而人表皮生长因子的添加能够促进细胞增殖，缩短细胞的倍增时间[14, 15]。
目前，MSCs的鉴定采用2006年国际细胞治疗协会（International Soeiety for Cellular Therapy，ISCT）提出的标准，包括以下几方面：①细胞形态为成纤维细胞样，具有贴壁生长特性；②阳性表达间质系表面标志物，如CD73（SH3和SH4），CD105（SH2）和CD90（Thy1）等，阴性表达造血干细胞表面标志物，如：CD45，CD19，CD19或CD79、CD14或CD11b和HLA-DR等；③具有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的多向分化潜能[16, 17]。本实验对gBM-MSCs生物学特征进行了系统研究，结果显示，gBM-MSCs体外培养时具有贴壁特性，呈梭形或纺锤形，具有较强的增殖能力，符合MSCs的基本特征；可连续稳定传代至15代以上，第15代gBM-MSCs仍然具备正常二倍体核型；第5代gBM-MSCs表达间质系表面标志物，如：CD13、CD29、CD44、CD106、CD90及CD166，而不表达造血干细胞表面标志物CD45及CD34；体外诱导培养后，gBM-MSCs能够向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化；以上结果说明我们分离获得的细胞具备MSCs的生物学特性。这一结果与Ren等[18, 19]的报道相似，他们研究显示，绒山羊gBM-MSCs表达间质系表面标志物CD29、CD44和CD90，不表达内皮及造血干细胞表面标志物CD31及CD45，体外可以向骨细胞、神经细胞诱导分化。
在此基础上，我们通过荧光定量PCR法检测多向分化相关基因PPARG、GLA和LUM动态表达情况。Rosen等研究显示，PPARG通过结合脂肪细胞特异基因，如脂肪酸结合蛋白和脂肪细胞P2基因，在脂肪形成过程中扮演重要角色[20, 21]。我们发现成脂肪诱导后PPARG表达量随着诱导天数的增加逐步上升。GLA是成骨特异性表达基因，与骨矿化基质的形成有关[22, 23]。我们发现成骨诱导后GLA表达随着诱导天数的增加逐步上调，此结果与Açil等[24]的研究一致，他们发现人骨髓MSCs成骨分化过程中，碱性磷酸酶和骨钙蛋白表达上调。LUM编码形成亮氨酸丰富的蛋白多糖家族，包括聚糖、双链蛋白聚糖和纤维调节蛋白，也可能参与到胶原原纤维的构建[25]。我们发现成软骨诱导后LUM表达量同样随着诱导天数的增加逐步上升，诱导21 d时，表达显著上调。本实验发现体外诱导培养gBM-MSCs后，多向分化相关基因的表达水平随着诱导天数的增加呈上升趋势，进一步证实gBM-MSCs具有多向分化潜能。
综上所述，采用全骨髓贴壁培养法能够从阿尔巴斯绒山羊骨髓中分离gBM-MSCs，获得的gBM-MSCs具有自我更新及多向分化潜能。此培养法操作简单，可大量分离及纯化gBM-MSCs，可以为后续转基因动物新品种培育及组织工程提供充足种子细胞，具有重要现实意义。
4 结论本研究从阿尔巴斯绒山羊骨髓中分离培养获得了gBM-MSCs，该细胞符合国际细胞治疗协会提出的MSCs鉴定标准，具备MSCs生物学特性，可以用于后续实验研究。
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