2. 江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122
2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122
L-茶氨酸（L-Theanine，L-The）由日本科学家于1949年首次从绿茶中分离得到[1]，是茶叶中特有的游离氨基酸，是天然茶叶中的重要风味物质，具有抑制苦味物质、改善产品风味的作用。同时L-The还有镇静放松[2, 3]、降低血压[4, 5]、控制体重[6]、增强免疫应答[7, 8]、预防肿瘤[9, 10, 11]等功效，因此在食品添加剂和保健品中被广泛应用。L-The自然界含量极少，从茶叶中提取成本很高，因此化学合成法是目前研究的主要方向。但是化学合成法存在反应时间长、收率低等缺点，同时由于需要采用高压惰性气体保护，因而生产成本居高不下。近年来，微生物发酵法和酶转化法已成为研究的热点。
γ-谷氨酰转肽酶（γ-Glutamyltranspeptidase，GG-T，EC 2.3.2.2）是谷胱甘肽代谢途径中的一个关键酶，2002年Suzuki等[12]研究报道，Escherichia coli K-12来源的GGT酶可以将L-谷氨酰胺（L-Gln）上的γ-谷氨酰基转移到乙胺受体上，催化合成L-The。由于这一过程位点特异性和光学选择性强，无需对反应物进行保护和脱保护，反应过程中也不消耗ATP，因此利用GGT酶转肽活性制备系列γ-谷氨酰基类化合物的研究成为生物催化领域的热点。
在实验室前期工作中已对GGT酶制备茶氨酸进行了初步研究，在L-Gln浓度为200 mmol/L时，L-The的摩尔转化率为78%，同时发现L-The的摩尔转化率随L-Gln浓度的升高而降低，在底物浓度为500 mmol/L和1 000 mmol/L时，转化率分别为58%和45%，产物浓度分别为290.2 mmol/L和450 mmol/L[12]，目前对高底物浓度条件合成L-The的研究尚无报道。在工业化生产中，较高的底物浓度可大大降低L-The的生产成本，因此本研究采用不同的补料策略，以期提高L-The在高浓度底物下的产量，为L-The的酶法工业化制备奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料菌种为实验室保存，L-Gln（上海生工生物工程股份有限公司），乙胺盐酸盐（上海生工生物工程股份有限公司），L-The标品（Sigma公司），其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法 1.2.1 粗酶液制备菌种活化后按体积分数2%的接种量接入发酵培养基中，25℃、200 r/min 培养48 h，装液量为250 mL发酵瓶装50 mL。培养结束后将培养液以8 000 r/min离心20 min，收集上清液。
1.2.2 GGT酶活测定方法以γ-谷氨酰对硝基苯胺和双甘二肽为底物进行颜色反应[13]。酶活测定体系为1 mL，含终浓度为5 mmol/L γ-谷氨酰对硝基苯胺，80 mmol/L 双甘二肽，50 mmol/L 硼砂-NaOH缓冲液，pH10.0，在37℃下加入20 μL适当稀释的酶液反应5 min后，加入4 mol/L醋酸溶液400 μL终止反应，在分光光度计410 nm处测定吸光值。该条件下每分钟生成1 μmol对硝基苯胺所需的酶量定义为一个酶活单位（U）。
1.2.3 酶法合成L-The取一定浓度的L-Gln和乙胺盐酸盐用硼砂-NaOH缓冲液溶于500 mL烧杯中，加入一定量酶液，调节pH为10.0，体系终体积为300 mL，放置于37℃恒温水浴锅，以150 r/min的搅拌转速进行酶反应，定时取样进行分析。
1.2.4 L-The的检测以高效液相色谱（HPLC）检测分析产物浓度[14]。
1.2.4.1 样品处理反应液取样后用10%（W/V）的三氯乙酸等体积稀释，室温放置1-2 h，12 000 r/min离心10 min，再用0.22 μm水相针式滤器过滤，此时样品可于HPLC检测。
1.2.4.2 流动相配置A相（1 L）：无水醋酸钠4.52 g，加入1 L去离子水，搅拌溶解，再加入225 μL三乙胺，醋酸调节pH到7.2±0.05，后加入5 mL四氢呋喃，混合后备用。
B相（1 L）：无水醋酸钠4.52 g，去离子水定容为200 mL，醋酸调节pH到7.2±0.05，再加400 mL 甲醇（色谱纯）和400 mL乙腈（色谱纯）。
A，B 相配置完毕后需用无油真空泵过膜抽滤，其中A 相使用0.22 μm 的纤维素膜，B 相使用0.45 μm尼龙膜，并将抽滤后的流动性与超声清洗器中超声15-30 min 排除气泡。
1.2.4.3 衍生化试剂及程序柱前衍生化反应采用邻苯二甲醛（OPA）与2-巯基乙醇联用，缓冲液为0.4 mol/L的硼酸缓冲液（pH10.2），具体试剂配方和柱前衍生化程序由Agilent公司提供。
1.2.4.4 HPLC色谱条件检测系统：Agilent 120；色谱柱：Eclipse XDB-C18 5 μm（4.6 mm×150 mm）；流动相：乙腈一水（75∶25）；流速：0.8 mL/min；柱温：40℃；紫外检测波长：338 nm。
梯度洗脱程序：流动相完全由A、B 两相组成，初始比例为A∶B = 92∶8（V/V），一个样品分离时间为20 min，流动相混合比例呈匀速线性变化，具体条件为：0-12 min，B 相为8%-26%（V/V）；12-14 min，B 相为26%-100%（V/V）；14-15.5 min，B 相保持100%（V/V）；15.5-18.5 min，B 相为8%-100%（V/V）；18.5-20 min，B 相保持8%（V/V）。
1.2.5 L-The产率的计算L-The摩尔转化率公式：
前期研究表明，采用酶转化法生产L-The时，底物浓度过高会导致L-The转化率下降，其原因主要是因为高浓度的底物L-Gln对GGT酶具有抑制作用，因此考虑使用较低的初始底物浓度，反应过程中补加L-Gln的补料策略以实现L-The的高浓度底物高转化率生产。为确定补料过程的初始条件，首先研究了不同底物浓度和不同加酶量对L-The合成的影响。根据前期工作的结果，GGT酶催化合成L-The在底物浓度较低的条件下反应速度较快，且转化率较高[13]，因此选择研究L-Gln浓度为200 mmol/L和100 mmol/L 条件下，研究不同加酶量对反应的影响。
首先以200 mmol/L L-Gln和2 mmol/L乙胺盐酸盐为底物，研究加酶量为2、6和10 U/mL时，对L-The合成的影响。结果（图 1）显示，在加酶量为2 U/mL时，酶转化在前3 h反应较快，后2 h反应逐渐趋于平衡；而在加酶量为6 U/mL 和10 U/mL时，酶转化在前2 h反应较快，后3 h反应逐渐平衡。在反应进行至2 h时，L-The对底物L-Gln的摩尔转化率分别为29.5%、54.4%和58.9%，反应5 h转化率分别为62.4%、69.3%和77.1%。以100 mmol/L L-Gln和1 mol/L乙胺盐酸盐为底物，研究加酶量为2、4和6 U/mL时对L-The合成的影响。结果（图 2）显示，当加酶量分别为2、4和6 U/mL，反应进行至2 h时，L-The对L-Gln的摩尔转化率分别为44.2%、60.2%和80.9%，最终转化率分别为80.4%、92.5%和93.6%。
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| 图 1 L-Gln 初始浓度为200 mmol/L 的过程曲线 |
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| 图 2 L-Gln 初始浓度为100 mmol/L 的过程曲线 |
综上所述，在不同底物浓度的条件下，加酶量为2 U/mL时，酶反应在前3 h速率较快，加酶量为6 U/mL和10 U/mL时，酶反应都在前2 h速率较快，2 h后反应速率降低，因此初步确定以2 h作为后续补料过程的补料间隔。图 1和图 2显示，底物L-Gln浓度为200 mmol/L，加酶量6 U/mL与10 U/mL相差7.8%，但是比2 U/mL有明显提高，所以加酶量6 U/mL是最优条件，此条件下反应2 h产物浓度达到120 mmol/L左右。而在L-Gln浓度为100 mmol/L时，反应2 h产物浓度最高仅能达到80 mmol/L，由于工业生产追求的是高产量，也就是较高的产物浓度，所以选择底物浓度200 mmol/L，加酶量6 U/mL作为后续补料过程的初始条件。
2.2 酶转化生产L-The恒速补料策略研究以200 mmol/L L-Gln和2 mol/L乙胺盐酸盐为初始底物，加酶量为6 U/mL，在pH 10.0和37℃条件下，研究不同的补料量对L-The合成的影响。由于将底物维持在较低浓度能保持较高的反应速率，所以选择每2 h进行恒速补料，L-Gln补料量分别为200、150和100 mmol。
首先以每2 h添加200 mmol L-Gln固体粉末的补料方式，研究对L-The合成的影响。由于合成L-The的反应要求L-Gln与乙胺盐酸盐的摩尔比在1∶5-1∶10范围内，因此在反应过程中每4 h补加400 mmol乙胺固体以保证乙胺盐酸盐的浓度。结果（图 3）显示，底物L-Gln在反应前4 h消耗较大，每2 h浓度下降120 mmol/L左右，随着反应进行，L-Gln消耗速率逐渐降低，反应至4-6 h时，L-Gln消耗速率为89.5 mmol/L，6-8 h为80.4 mmol/L，分析原因是由于随着酶转化反应进行，反应液L-Gln和L-The浓度都逐渐上升，正逆反应速度逐渐达到平衡，致使反应速率进一步下降。8-11 h和11-14 h底物浓度下降仅为37.6 mmol/L和22.5 mmo/L。反应至14 h最终L-Gln的总浓度为1 000 mmol/L，L-The的浓度达到562 mmol/L，转化率为56.2%。
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| 图 3每2 h 补料200 mmol 的恒速补料过程曲线 |
以每2 h添加150 mmol L-Gln固体粉末，每4 h补加400 mmol乙胺盐酸盐固体的补料方式，研究对L-The生产的影响。结果（图 4）显示，L-Gln在反应前6 h消耗较快，每2 h消耗量为120 mmol/L左右，6 h后L-Gln消耗速率降低，6-8 h底物消耗量为97.6 mmol/L，8-10 h底物消耗量为56.4 mmol/L，10 h后反应速率大幅下降，反应在14 h左右时达到平衡。最终L-Gln的总浓度为950 mmol/L，L-The的浓度达到573 mmol/L，转化率为63.7%。
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| 图 4 每2 h 补料150 mmol 的恒速补料过程曲线 |
研究以每2 h添加100 mmol L-Gln固体粉末，每4 h补加400 mmol乙胺盐酸盐固体的补料方式对酶转化的影响。结果（图 5）显示，L-Gln在反应前8 h消耗很快，每2 h消耗量为120 mmol/L左右，8 h后L-Gln消耗略有降低，8-10 h L-Gln消耗量为80.3 mmol/L，10-12 h为54.8 mmol/L，12 h后反应速率下降，L-Gln几乎不消耗。而L-The在前12 h的合成速率都较大，12 h后速率下降，约在16 h达到平衡。最终L-Gln的总浓度为900 mmol/L，L-The的浓度达到610.1 mmol/L，转化率为67.8%。
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| 图 5 每2 h 补料100 mmol 的恒速补料过程曲线 |
根据上述的结果，在恒速补料的情况下，反应初期底物浓度较低，所以反应速率较快，而反应后期由于底物的累积导致反应变慢，逐渐达到平衡。因此尝试采用变速补料的工艺，以200 mmol/L L-Gln和2 mol/L乙胺盐酸盐为初始底物，加酶量为6 U/mL，在pH10.0和37℃条件下，每2 h测定L-Gln的含量，从而确定补加L-Gln的量，保证补料后L-Gln浓度为200 mmol/L，同时每4 h添加400 mmol乙胺盐酸盐固体，研究变速补料对L-The合成的影响。结果（图 6）显示，每2 h所需补加的L-Gln量在反应前期较多，随着反应进行，反应速率降低，补加的底物逐渐减少，反应进行到18 h后，反应液中底物浓度几乎不变，可以认为反应已经达到平衡，所以不再进行补料。最终L-Gln总浓度为600 mmol/L，L-The浓度最终达到445.8 mmol/L，转化率为74.3%。
2.4 不同补料工艺的研究通过对恒速补料和变速补料工艺的比较发现，不同的转化工艺所需的反应周期不同，产生的L-The的浓度也不同。表 1显示，从转化率角度，变速补料工艺的转化率最高，达74.3%，但所达到的底物浓度仅为600 mmol/L，导致生产强度较低，为29.7 mmol/（h·L），远低于恒速补料的生产强度。而比较不同的恒速补料策略，生产强度差异较小，转化率和产物终浓度都以100 mmol/2 h恒速补料工艺最高，达67.8%和610.1 mmol/L，基本满足了L-The在高底物浓度条件下能达到高转化率和高产物浓度的要求。因此，以100 mmol/2 h恒速补料进行茶氨酸的生产最能适应工业化生产要求。
L-The作为一种具有重要价值的非蛋白氨基酸，已经成为研究茶叶中功能活性成分的热点。目前L-The的合成主要以化学合成法为主，但是化学合成得到的产物存在一定的安全性问题，同时容易产生DL-型消旋体，因此近年来以酶法合成L-The逐渐被广泛研究。
2002年，来自日本的Suzuki等[15]利用GGT酶，以200 mmol/L的L-Gln和1.5 mol/L的乙胺为底物合成L-The，转化率可达到60%，产物浓度为120 mmol/L。Shuai等[16]以20 mmol/L的L-Gln和0.05 mol/L的乙胺为底物，L-The的转化率达到94%，产物浓度为18.8 mmol/L。孙帅[17]以200 mmol/L的L-Gln和1.8 mol/L乙胺合成L-The，反应36 h转化率达到86%，产物浓度达到172 mmol/L。李勤等[18]将来源于E. coli DH5α的GGT酶基因克隆到高表达质粒pET-32α中，并转化E. coli BL21，构建茶氨酸生物合成的工程菌，直接以工程菌为催化剂，以L-Gln和乙胺盐酸盐为底物，在一定条件下反应6 h，L-The转化率为41.05%。
利用其它酶转化L-The的研究也有报道。1998年，Tachiki等[19]利用谷氨酰胺酶，以500 mmol/L的L-Gln和1.5 mol/L的乙胺为底物，L-The的转化率为47%，产物浓度为235 mmol/L。2005年，Yamamoto等[20]报道了以200 mmol/L的L-谷氨酸钠和1.2 mol/L的乙胺为底物，L-The的转化率达到85%，浓度为170 mmol/L的产物。2008年，Tachiki等[21]以300 mmol/L的L-Gln和0.9 mol/L的乙胺为底物，获得L-The的转化率为55%，浓度为165 mmol/L的产物。Yokoyama和Itoh[22, 23]分别报道了一种在介孔硅材料上固定化谷氨酰胺酶，再由其催化合成L-The的方法。2008年，Yamamoto等[24]利用γ-谷氨酰甲胺合成酶，以600 mmol/L的L-谷氨酸钠和0.6 mol/L的乙胺为底物，L-The的转化率可达到100%，产物浓度达到600 mmol/L。
传统的酶转化过程中，在底物浓度较低的情况下，L-Gln消耗速率较快，L-The合成速度快；而在高底物浓度下，L-Gln消耗减慢，产物合成速率较慢。因此本实验研究了不同的补料方法，并通过比较得出以200 mmol/L的L-Gln和2 mol/L的乙胺盐酸盐为初始底物，加酶量6 U/mL，每2 h补加100 mmol L-Gln，反应16 h为最优工艺。在最优条件下L-The的转化率可以达到67.8%，产物浓度达到610.1 mmol/L，生产强度为38.1 mmol/（h·L）。
4 结论通过采用恒速补料和变速补料的策略，在L-Gln浓度为900 mmol/L和600 mmol/L时，转化率分别达到67.8%和74.3%，生产强度分别为38.1 mmol/（h·L）和29.7 mmol/（h·L）。本研究通过补料工艺进行L-The的合成，即使在高底物浓度下，仍能获得令人满意的底物转化率，且步骤简单，成本低廉，具有较好的应用前景。
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