蚕蛹（Silkworm pupa）为蚕蛾科昆虫家蚕蛾的蛹，蛹中随产地和品种不同含有59.9%-66.2%的蛋白质，28.9%-33.1%的粗油脂，以及多种维生素和铁、锌、硒微量元素^[1]。作为被卫生部列为“食品新资源”中唯一的昆虫类食品源，蚕蛹中蛋白不但含有人体必需的18种氨基酸，而且必需氨基酸含量高达42.2%^[2]，必需氨基酸与非必需氨基酸质量比为0.73∶1，营养价值极高。更难得的是，蚕蛹蛋白及其降解多肽具有促进肝细胞再生，提高免疫机能，降血压^[3]、抗氧化^[4]、抗疲劳^[5]等生物学功效。我国是蚕蛹资源大国，每年缫丝副产品所得干蛹高达70万t以上，占世界蚕蛹总产量的80%以上。目前蚕蛹除极少部分被食用和入药外，因为蛹腥味和深加工技术落后导致绝大部分被用作饲料和肥料，资源利用率和附加值极低。

蚕蛹蛋白具有制成食品、营养保健品、药品等方面的广阔应用前景，但要消除其不利因素走近人们生活，就需要对蚕蛹进行精制和深加工，因蚕蛹脂肪含量高，并带有强烈异味，蚕蛹脱脂就成为精制过程中最重要的环节。通过脱脂结合其他工艺处理可以得到纯净的、无腥臭味的蚕蛹蛋白，为其后续深加工和工业应用奠定基础。在现有的蚕蛹脱脂研究方法中，机械压榨法由于脱脂率低、劳动强度大、饼粕蛋白易变性等缺点已被多数研究者放弃；超临界CO₂萃取^[6]和亚临界萃取法则由于设备昂贵和批处理量小等缺陷，无法适应工业化大生产的要求；溶剂浸出法^{[7, 8]}因其操作简单、处理量大、脱脂率高等特点受到了众多研究者的青睐而迅速发展和不断完善，蚕蛹蛋白工业化生产和应用已现曙光。黄小霞^[9]经科学研究得出蚕蛹最佳脱脂工艺为：干蚕蛹与环己烷的质量比为1∶1.5，浸出温度80℃，保温时间6 h条件下一次浸出残油率为8.8%，经6次浸出可得残油率低于2%的蚕蛹。但目前在蚕蛹蛋白脱脂的研究中，多采用高温、长时、强极性或毒性溶剂浸提或极大的液料比来获得较高的脱脂率^{[9, 10, 11, 12, 13]}。高温长时间的脱脂工艺会使生成的蚕蛹蛋白蛹臭味浓，颜色较深，需要进一步采用有机溶剂或者臭氧脱色脱臭，而且会造成蛋白的变性，对其加工特性（如起泡性，溶解性等）造成不同程度的影响^[14]；强极性溶剂对蛋白质的吸附力强，溶剂残留问题难以解决；较大的料液比在一定程度上会增加生产造成的占地规模、能耗、废水处理等成本，不利于蚕蛹蛋白的工业化生产。

超声波的强烈振动和空化效应，可以加速天然生物质成分的溶出和浸出，超声辅助提取具有提取温度较低，物质活性不易被破坏，提取时间短，产率高等优点^{[15, 16]}。本实验以缫丝蚕蛹为原料，选择在常温下易挥发、对人体友好的溶剂脱脂体系，研究超声处理对蚕蛹蛋白脱脂的影响，通过单因素分析及响应面优化建立常温下超声辅助蚕蛹脱脂工艺条件，以期为蚕蛹活性蛋白的工业化生产提供一定的实验依据。

蚕蛹由湖北省农科院蚕业研究所提供，研究中主要试剂正已烷、石油醚Ⅰ类、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、无水乙醚、无水乙醇均为分析纯。仪器：JP-300A型高速多功能粉粹机（永康市久品工贸有限公司）；BSA224S-CW型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；101-2AB型电热恒温干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；DZF-6020型电热真空干燥箱（上海市精宏仪器有限公司）；3K30型台式冷冻离心机（德国sigma公司）；SCIENTZ-IID型超声波细胞粉碎机（宁波新芝科技有限公司）；SHZ-88型恒温水浴振荡器（江苏省金坛市医疗仪器厂）；RE52-3型旋转蒸发仪（上海沪西分析仪器厂）。

手工去除缫丝蚕蛹的蛹皮和腺体，用稀盐酸浸泡中和碱性表面杂质，用水反复清洗至pH呈中性。得到的去杂湿蛹置于电热真空干燥箱中60℃干燥，粉碎，过60目筛，蛹粉收集备用。

取一定量蚕蛹粉（置于滤纸包中）与待选脱脂溶剂按照液固比10 mL/g混合，采用索氏提取法进行脱脂处理，注意提取器中滤纸包应低于虹吸管的高度，提取时间为2 h，提取液经离心后旋转蒸发回收溶剂，得粗蛹油。

将蚕蛹粉与脱脂溶剂按不同液固比混合并振摇3 min后，在40℃下对蚕蛹粉超声脱脂若干时间。脱脂结束后10 000 r/min离心分离得脱脂液和脱脂蛹粉，脱脂液经旋转蒸发，并真空干燥去除残余溶剂得粗蛹油；脱脂蛹粉于60℃干燥去除残余溶剂得粗蛹蛋白。

确定脱脂溶剂后，以液固比、超声时间、超声功率为考察因子，以蚕蛹脱脂率作为考核指标进行单因素实验设计；并在单因素实验基础上，采用Box-Behnken设计原理^[17]对上述3个因子进行响应面优化实验。

蚕蛹中总脂肪质量的测定可采用索氏抽提法，具体方法可参照GB/T 14772-2008《食品中粗脂肪的测定》。

脱脂率（%）=提取的蚕蛹油质量/蚕蛹总脂肪质量×100%

每个样品平行测定3次，实验数据采用Excel、SPSS及Design Expert 7.1.3等软件进行统计分析。

脱脂溶剂体系是影响蚕蛹脱脂率及脱脂蚕蛹溶剂残留的关键因素，本研究利用索氏提取法考察了油脂提取过程中使用率较高的7种溶剂（正已烷、石油醚Ⅰ类、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、无水乙醚、无水乙醇）在40℃下对蚕蛹粗油脂的脱除能力。结果（表 1）显示，待选溶剂在常温下均有较好的蚕蛹粗油脂脱除能力，其中高极性溶剂中丙酮的脱脂效果最好，低极性溶剂中石油醚（Ⅰ类）脱脂效果较佳。高极性溶剂油脂脱除效率普遍高于低极性溶剂，这与蚕蛹粗油脂中不饱和脂肪酸和极性物质含量较高有关，符合相似相溶原理。根据对蛹油的感官评价结果，可以得知高极性溶剂脱脂过程中还将部分非油脂极性物质如蛹臭味物质一同浸出。

表 1 多种有机溶剂索氏提取脱脂结果

表选项

为了更好地脱除蚕蛹油脂和非蛋白物质，在考察了溶剂极性、沸点、毒性以及蚕蛹脱脂效率的基础上，研究了高极性溶剂和低极性溶剂组成的混合溶剂（石油醚Ⅰ类-丙酮）在40℃下对蚕蛹粗油脂的脱除能力。石油醚和丙酮可以以任意比例混合，混合后沸点在30-60℃，结果（表 2）显示，混合有机溶剂体系在石油醚∶丙酮=3∶7时有着最佳的油脂脱除效果。

表 2 混合溶剂索氏提取脱脂结果

表选项

在超声波辅助下，以石油醚-丙酮（3∶7）为脱脂溶剂，在40℃对蚕蛹粉进行脱脂处理。研究了单因素（液固比、超声功率、超声时间）对蚕蛹脱脂率的影响，并通过响应面法确定最佳超声辅助脱脂工艺。

研究了在超声辅助和非超声辅助条件下，以石油醚-丙酮（3∶7）为脱脂溶剂，40℃时不同液固比对蚕蛹脱脂率的影响。超声辅助参数为：超声波频率24 kHz、超声波工作时间1.5 s、间歇时间1.5 s、超声波功率130 W、处理时间25 min；非超声对照组以40℃水浴100 r/min振摇25 min代替超声处理。脱脂结果（图 1）显示，与非超声对照组相比，超声处理能够显著改善蚕蛹粗油脂的脱除效率，并且超声辅助的脱脂效率随着液固比的增加而愈加显著；在恒定超声功率、频率和超声时间条件下，随着脱脂溶液与蚕蛹粉质量比例的增加，脱脂率随之快速增加，当液固比超过10 mL/g后变化逐渐平缓。考虑到溶剂原料成本和工业生产中的可行性，在超声辅助条件下，蚕蛹脱脂过程中液固比设定在8-12 mL/g之间为宜。

图 1 液固比对蚕蛹脱脂率的影响

图选项

以石油醚-丙酮（3∶7）为脱脂溶剂，在超声波频率24 kHz、超声波工作时间1.5 s、间歇时间1.5 s、液料比10 mL/g、处理时间25 min条件下，研究不同超声功率对蚕蛹脱脂率的影响。结果（图 2）显示，当恒定超声时间（25 min）和液固比（10∶1）条件下，起初脱脂率随着超声功率的增加而增加，当超声功率大于130 W后，继续增大超声功率会导致油脂脱除率逐渐降低。

图 2 超声功率对蚕蛹脱脂率的影响

图选项

以石油醚-丙酮（3∶7）为脱脂溶剂，在超声波频率24 kHz、超声波工作时间1.5 s、间歇时间1.5 s、超声波功率130 W、液料比10 mL/g条件下，研究不同超声时间对蚕蛹脱脂率的影响。结果（图 3）表明，当脱脂时间小于25 min，蚕蛹脱脂率随超声时间增加而上升；超声25 min时的脱脂率最高，大于25 min后脱脂率随超声时间增加而缓慢下降。

图 3 超声时间对蚕蛹脱脂率的影响

图选项

根据单因素实验结果，以石油醚-丙酮（3∶7）为脱脂溶剂，采用Box-Behnken设计原理，以蚕蛹粗油脂脱除率为响应值，选取液固比、超声功率和超声时间进行三因素三水平的旋转正交实验设计，响应面实验的因素水平设计见表 3。Box-Behnken设计方案共有17次处理，实验结果见表 4。

表 3 超声辅助蚕蛹脱脂工艺组合设计方案

表选项

表 4 超声辅助蚕蛹脱脂工艺组合实验结果

表选项

使用Design Expert 7.1.3分析统计软件对表 4实验结果进行回归拟合分析，得到蚕蛹脱脂率（Y）与液固比（X1）、超声功率（X2）和超声时间（X3）之间的响应面回归模型为：Y =95.44+4.69X1-0.45X2+1.31X3-0.35 X1X2-0.025X1X3-0.3X2X3-2.88X1²-0.91X2²-1.73X3²。表 5显示，除X1、X3、X1²和X3²对蚕蛹脱脂率的影响极显著（P<0.01）外，其他各项对蚕蛹脱脂率的影响不显著（P>0.05），各因素对蚕蛹脱脂率的影响大小顺序为：液固比>超声时间>超声功率。该模型回归性极显著（P<0.000 1），失拟项P=0.492 4，差异不显著，说明该模型拟合精确、可信，可用于预测、分析蚕蛹超声辅助脱脂过程。

表 5 响应面回归模型的方差分析

表选项

采用Design Expert 7.1.3分析统计软件获得液固比（X1）、超声功率（X2）和超声时间（X3）相互之间的响应曲面（图 4）。

图 4 各因素及交互作用对蚕蛹超声辅助脱脂的影响

图选项

超声功率（X2）与液固比（X1）对蚕蛹脱脂率的响应面（图 4-A）显示，液固比与超声功率之间存在着微弱交互作用。其中蚕蛹脱脂率随着液固比的提高不断升高，超声功率对蚕蛹脱脂率的影响先增后抑，当超声功率和液固比增加到一定值后，超声功率的抑制因素大于液固比的增强因素，因此，在超声时间不变的情况下，液固比与超声功率对蚕蛹脱脂率的响应面存在极值，在液固比10-12 mL/g和超声功率125-130 W范围内，蚕蛹脱脂率较大。

超声时间（X3）与液固比（X1）对蚕蛹脱脂率的响应面（图 4-B）显示，液固比与超声时间之间存在着微弱交互作用。其中蚕蛹脱脂率随着液固比的提高不断升高，超声时间对蚕蛹脱脂率的影响先增后抑，当超声时间和液固比增加到一定值后，超声时间的抑制因素大于液固比的增强因素，因此，在超声功率不变的情况下，液固比与超声时间对蚕蛹脱脂率的响应面存在极值，在液固比10-12 mL/g和超声时间25-30 min范围内，蚕蛹脱脂率较大。

超声时间（X3）与超声功率（X2）对蚕蛹脱脂率的响应面（图 4-C）显示，超声功率与超声时间之间存在着显著交互作用。随着超声功率与超声时间的增加，蚕蛹脱脂率先增后减。在液固比不变的情况下，超声功率与超声时间对蚕蛹脱脂率的响应面也存在极值，在超声功率125-130 W和超声时间23-28 min范围内，蚕蛹油提取率较大。

综上所述，由于液料比（X1）、超声功率（X2）和超声时间（X3）两两之间的响应面均存在极值。因此，通过对二次回归的数学模型取一阶偏导得到最优实验条件为：液固比11.68 mL/g、超声波功率125.21 W、超声时间27.07 min。在此条件下，蚕蛹脱脂率的预测值为98%，对以上最优提取条件调节取整，按液固比11 mL/g、超声波功率125 W、超声时间27 min进行验证实验，经3次平行实验，蚕蛹脱脂率分别为96.7%、97.6%和96.1%，平均值为96.8%。验证脱脂率略低于预测值，这可能是因为液固比的微调、脱脂各影响因素之间交互作用对脱脂率的影响以及脱脂体系中部分油脂重新吸附到蛋白表面所致。验证结果与理论预测值相当接近，表明预测值与真实值之间有很好的拟合性，进一步验证了模型的可靠性。

蚕蛹脱脂处理是蚕蛹深加工和蚕蛹蛋白精制的重要环节。在现有的蚕蛹脱脂技术中，溶剂浸出法具有操作简单、处理量大、油脂脱除率高等优点备受青睐并极具工业化前景，针对现有溶剂脱脂工艺中常采用的高温、长时、强极性或毒性溶剂浸提而带来的蚕蛹蛋白变性和溶剂毒性残留等问题，研究出一种脱脂高效、低温短时无残留、蛋白变性压力小的新脱脂工艺正当其时。

本研究确定的蚕蛹脱脂溶剂体系是石油醚-丙酮（3∶7），该溶剂体系低毒易挥发，中等沸点，对蚕蛹油脂中的极性和非极性成分具有较好的溶解性，因此该溶剂体系不但具有良好的脱脂性能，还具有一定的脱色脱臭能力。关于溶剂用量方面，实验中确定的液固比为11 mL/g，主要考虑到随着液固比的升高，脱脂率和溶剂成本随之升高，但脱脂率的升高幅度会逐渐减缓。从工业化成本考虑，宜选择脱脂率/液固比比值较大时的溶剂用量。

考虑到蚕蛹蛋白变性压力及缩短脱脂时间，本研究选择了超声辅助常温脱脂工艺。超声波作为一种物理的手段和工具，具有粉碎、搅拌等特殊作用，可打破动植物细胞，使溶媒尽快渗透到细胞中，加快其活性成分溶出^{[18, 19]}，为科研工作者提供了一条能够把能量引入到细胞及分子中的高效途径和方法。本实验利用超声波破碎细胞（空化作用）和强化传质（机械作用），强化萃取速率和效果，缩短提取时间，减少溶剂用量，加速油脂的脱除效率。在实验中利用40℃下超声波功率125 W、超声时间27 min对蚕蛹进行了脱脂处理，获得了非常理想的脱脂效果。

采用响应面分析法优化了常温下超声波辅助混合溶剂法脱除蚕蛹油脂的工艺，脱脂溶剂选择石油醚-丙酮（3∶7），常温下进行超声处理，各因素对蚕蛹脱脂率的影响程度强弱依次为液固比>超声时间>超声功率；确定最优工艺条件为液固比11.68 mL/g、超声波功率125.21 W、超声时间27.07 min；该工艺条件从便于操作考虑微调为：液固比11 mL/g、超声波功率125 W、超声时间27 min，在此条件下，验证蚕蛹脱脂率为（96.8±0.8）%。