在微生物学研究中，高温菌也称嗜热菌或好热菌，具有嗜热和耐热的特性^[1]。由于高温微生物及其活性物质可以在高温条件下行使功能，具有超常的生物学稳定性，能够实现一般生物技术难以达到的目的。高温菌的利用有助于突破当前生物技术领域中的一些局限，为提高生物技术能力开辟了重要途径，因此在生物技术领域具有重要的应用潜力，特别是嗜热酶作为酶制剂具有制备成本低、动力学反应快、热稳定性好等优点^[2]，在轻工、食品、化工等众多领域都得到了广泛应用^[3]。

高温菌在地球上分布广泛，不仅存在于地热环境中，在人工高温环境、地下油层甚至空气中都曾发现有高温菌的存在，但通常分布在陆地温泉、海底热泉、地壳内部、酸性硫磺区等自然高温环境中及高温堆肥、烟囱、热水器、热污染河流等人工高温环境中^[4]。本研究从经121℃灭菌20 min的斜面培养基中分离到一株高温菌CICC 10853，通过表型、生理生化、16S rRNA基因和recN基因序列分析的多相鉴定技术确定该菌株的分类学地位，旨在为进一步了解其生物学功能奠定基础。

CICC 10853分离于CICC实验室的斜面培养基。

酵母粉 0.5 g，蛋白胨 0.5 g，酪蛋白水解物0.5 g，葡萄糖 0.5 g，可溶性淀粉 0.5 g，丙酮酸钠 0.3 g，磷酸氢二钾 0.3 g，硫酸镁0.1 g，琼脂 15.0 g。蒸馏水 1.0 L，pH7.2。121℃高压蒸汽灭菌20 min。

R2A培养基分装试管，121℃灭菌20 min，冷却至50-55℃摆斜面，凝固后置于37℃培养箱空置培养2 d，确认无菌。在56℃ 培养48 h，长出菌落后，利用R2A平板划线培养，挑取单菌落转接到新鲜的R2A斜面培养后于4℃保藏。

将供试菌株接种于R2A平板上，56℃培养24 h。取新鲜菌体进行革兰氏染色并镜检，染色方法参照《常见细菌系统鉴定手册》^[5]。同时进行扫描电镜切片并镜检、拍照。

利用细菌基因组DNA提取试剂盒（Tiangen公司）提取菌株CICC 10853基因组DNA，具体步骤参见试剂盒说明书。以基因组DNA为模板，利用通用引物F27/1492R扩增16S rRNA基因^[6]。测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。测序结果用Chromas软件参照正反序列图谱人工校对，测序结果在EzTaxon数据库中进行比对^[7]，确定与已知近缘种序列的相似性。采用CLUSTAL W对CICC 10853及其若干近缘种16S rRNA基因序列进行多序列比对^[8]，并利用N-J法通过MEGA 5软件进行系统发育树分析^[9]。

以菌株CICC 10853的基因组DNA为模板，对靶基因recN（DNA修复和基因重组蛋白N亚基基因）进行扩增，PCR及反应条件参照^[10]。纯化后的PCR产物由北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。测序得到的结果在GenBank数据库中进行比对分析，并通过MEGA 5软件进行系统发育树分析^[9]。

采用API 50CH及API 20E试剂条对CICC 10853 的碳源利用及其产酸情况、酶活性等生理生化特征进行检测，具体操作方法按试剂条使用说明书进行。生长温度实验和耐盐性实验依据《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》^[11]（第2版）中地芽胞杆菌属相关内容，温度选择35℃、40℃、45℃、70℃和75℃，NaCl终浓度选择1%、2%、3%、4%和5%。

菌株CICC 10853在R2A培养基上，菌落黄色、不透明、圆形、表面光滑（图 1-A）。利用光学显微镜观察显示菌体细胞长杆状，单个或成链状排列。革兰氏染色阳性，有芽胞，芽胞椭圆或柱状、端生或次端生，膨大明显（图 1-B）。菌体电子显微镜观察，菌体长度2.0-3.0 μm，宽度0.4-0.6 μm，扫描电镜成像效果见图 1-C。

图 1 菌株CICC 10853形态学观察结果

图选项

测序得到的菌株CICC 10853的16S rRNA基因序列信息提交至GenBank，获得登录号KP729021。以Bacillus subtilis NCIB 3610^T（ABQL012016-2-1401）为外群，构建CICC 10853与相关近缘模式菌株的系统发育树（图 2）。

图 2 CICC 10853 16S rRNA基因系统发育分析

图选项

由系统发育分析可判断，CICC 10853应归属为地芽胞杆菌属（Geobacillus sp.），与好热地芽胞杆菌（Geobacillus kaustophilus）、火神地芽胞杆菌（G.vulcani）、立陶宛地芽胞杆菌（G.lituanicus）、噬热地芽胞杆菌（G.thermoleovorans）、加尔加泉地芽胞杆菌（G.gargensis）和热小链地芽胞杆菌（G.thermocatenulatus）等聚为一个系统发育分支，16S rRNA基因序列相似性均高于原核微生物种的界限98.65%^[12]。Dinsdale等^[13]根据API、脂肪酸成分、DDH等分析认为好热地芽胞杆菌（Geobacillus kaustophilus）、火神地芽胞杆菌（G.vulcani）、立陶宛地芽胞杆菌（G.lituanicus）、噬热地芽胞杆菌（G.thermoleovorans）应归为同一个种噬热地芽胞杆菌（G.thermoleovorans），另外加尔加泉地芽胞杆菌（G.gargensis）应为热小链地芽胞杆菌（G.thermocatenulatus）的同物异名。

recN 基因是地芽胞杆菌属内种间分子生物学鉴定的重要工具^[10]。以菌株CICC 10853的基因组DNA为模版，扩增recN 基因，基因序列信息提交至GenBank，获得登录号KP729022。以Bacillus subtilis subsp. subtilis 168^T（AL009126）为外群，构建CICC 10853与相关近缘模式菌株的系统发育树（图 3）。

图 3 CICC 10853 recN基因系统发育分析

图选项

recN 基因基因序列分析显示，菌株CICC 10853与好热地芽胞杆菌（Geobacillus kaustophilus）、火神地芽胞杆菌（G.vulcani）、立陶宛地芽胞杆菌（G.lituanicus）、噬热地芽胞杆菌（G.thermoleovorans）的recN基因序列相似度为98.9%，与热小链地芽胞杆菌（G.thermocatenulatus）的序列相似度为97.4%，而与其他近缘种的相似度均低于90%。CICC 10853与好热地芽胞杆菌（Geobacillus kaustophilus）、火神地芽胞杆菌（G.vulcani）、立陶宛地芽胞杆菌（G.lituanicus）、噬热地芽胞杆菌（G.thermoleovorans）的recN基因序列种间相似性均大于99%，这也进一步证明了Anna E. Dinsdale等人的结论。

因此，根据16S rRNA和recN 基因分析表明，CICC 10853应鉴定为噬热地芽胞杆菌（G.thermoleo-vorans）或热小链地芽胞杆菌（G.thermocatenulatus）。

菌株CICC 10853的酶活性、碳源利用及其产酸情况等生理生化特征结果详见表 1。结果显示菌株CICC 10853液化明胶，β-半乳糖苷酶反应阳性；能利用葡萄糖、果糖、核糖、D-木糖、半乳糖、甘露糖、淀粉、甘油、肌醇、甘露醇、α-甲基-D-葡萄糖甙、七叶灵等碳源物质，生长温度为45-70℃，培养基中NaCl终浓度1%时可生长，NaCl终浓度2%时不能生长。生理生化结果与噬热地芽胞杆菌（Geoba-cillus thermoleovorans）一致。

表 1 CICC 10853生理生化特征检测结果

表选项

依据形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA 基因及recN基因序列分析，分离自斜面培养基的菌株CICC 10853被鉴定为噬热地芽胞杆菌（Geobacillus thermoleovorans）。

2001年，Nazina等^[14]提出将芽胞杆菌属16S rRNA系统发育群GROUP 5的嗜热菌群独立出来，形成一个新属地芽胞杆菌属。该属菌种表型相近，革兰氏染色呈阳性（或可变），菌体杆状，芽胞端生。生长温度范围37-80℃。大部分种在自然环境中广泛存在，在温泉、油田、火山口和堆肥等高温环境，甚至土壤常温环境和极地低温环境中均有报道^[15]。地芽胞杆菌属正式发表的种共计19个，但近年来随着新种的发现和分子生物学的发展，原有种的分类学地位发生了很大变化，如脆弱地芽胞杆菌G. debilis归属到新属Caldibacillus sp.，命名为C. debilis；苍白地芽胞杆菌G. pallidus、脆弱地芽胞杆菌G. debilis转移到新属Caldibacillus sp.；喜温地芽胞杆菌Geobacillus tepidamans重新归属到无氧芽胞杆菌属Anoxybacillus sp.。好热地芽胞杆菌（G. kaustophilus）、火神地芽胞杆菌（G.vulcani）、立陶宛地芽胞杆菌（G. lituanicus）、噬热地芽胞杆菌（G. thermoleovorans）合并为一个种噬热地芽胞杆菌（G. thermoleovorans），同时加尔加泉地芽胞杆菌（G. gargensis）为热小链地芽胞杆菌（G. thermocatenulatus）的同物异名。截止目前该属仅存12个有效种，4个亚种^[16]。

Zeigler^[10]对68株地芽胞杆菌的recN 基因序列进行了分析，与16S rRNA基因相比，recN 基因在地芽胞杆菌种水平的鉴定区分度更高。本研究通过16S rRNA和recN 基因序列分析将菌株CICC 10853鉴定为噬热地芽胞杆菌（G. thermoleovorans）或热小链地芽胞杆菌（G. thermocatenulatus），菌株与噬热地芽胞杆菌（G. thermoleovorans）的recN 基因序列相似性（98.9%）高于热小链地芽胞杆菌（97.4%）。进一步综合表型、生理生化等分类特征，CICC 10853被鉴定为噬热地芽胞杆菌（G. thermoleovorans）这也进一步证明了Dinsdale等^[13]的结论。

噬热地芽胞杆菌CICC 10853是从经121℃灭菌20 min的斜面培养基中分离获得，可以推测其耐高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20 min不能将其彻底杀灭。该菌在40℃及以下温度不能生长，所以37℃空置培养时未能发现该菌的存在。此外，本研究针对CICC 10853进行碳源物质利用情况及相关酶的活性进行研究，确定其能液化明胶，同时具有β-半乳糖苷酶活性，能利用葡萄糖、果糖、核糖、半乳糖、甘露糖、淀粉及甘油等近20种碳源物质，为进一步开发该菌的生物学功能奠定重要基础。

依据多相鉴定技术，分离自斜面培养基的菌株CICC 10853被鉴定为噬热地芽胞杆菌（Geobacillus thermoleovorans）。