生长转化因子9（Growth differentiation factor 9，GDF9）和骨形态发生蛋白15（Bone morphogenetic protein 15，BMP15）都作为转化生长因子（TGF-β）超家族的成员，参与早期卵泡的生长和分化。1978年TGF-β由Delarco和Todaro在研究病毒时发现，它因具有促进单层培养的成纤维细胞转化并形成克隆而得名，TGF-β是目前发现最大的细胞内信号蛋白家族^[1]。其成员以自分泌和旁分泌的形式参与细胞生物活性的调节^{[2, 3]}。GDF9最早由Lee以TGF-β家族的保守区域为模板设计简并引物克隆得到，采用Northern blotting在小鼠卵巢中检测到mRNA表达^[4]。而BMP15最早是在绵羊中发现的，Aaltonen^[6]根据其基因的保守性首次克隆了小鼠的BMP15基因，后期以它为模板相继得到了人、大鼠及羊的BMP15的序列^[5]。Aaltonen在卵母细胞中发现BMP15的特异性表达。研究初期认为它们表达模式相似且仅在动物卵巢组织特异性表达，后期经深入研究发现不同物种表达定位存在不同。对牛羊的研究发现GDF9在睾丸和下丘脑组织中也表达，同时对人的研究显示在非性腺组织也检测到GDF9的表达。表明GDF9不仅在卵母细胞的排卵过程中表达^{[7, 8]}。后期有研究者对啮齿类动物研究发现GDF9在睾丸和下丘脑组织中也表达，同时对人的研究显示在非性腺组织也检测到GDF9的表达。BMP15也不仅在卵巢中表达，在人^[6]和牛^[9]睾丸及小鼠^[10]垂体中均检测到微量表达。随着对GDF9和BMP15的深入研究表明这些生长因子可能潜在调节垂体和睾丸的功能，参与调节动物生殖过程^[11]。

miRNA是一类非编码小分子RNA，长约20 nt，通过结合靶mRNA的3' UTR导致其或抑制翻译，参与调控转录后过程，进而参与生命进程。有研究表明，miRNA在卵巢及睾丸组织中参与调控。2007年Ro等^[12]小鼠卵巢中克隆得到122个miRNA，并对其进行半荧光定量PCR分析，发现其在卵巢和睾丸组织中均表达，而后发现包含miR-ov15和miR-ov9共4个miRNA在卵巢中特异性表达。2008年Otsuka^[13]发现Dicer（d/d）小鼠不育，将正常小鼠卵巢移植到此小鼠上可得到后代，将Dicer（d/d）小鼠卵巢移植到正常小鼠中无怀孕现象，说明卵巢发育是影响繁殖的关键因素。对Dicer（d/d）小鼠研究发现，miR-17-5p和let-7b影响黄体血管长度和数量，将其注射到Dicer（d/d）小鼠中可恢复黄体血管生成，但不能使胎儿发育，可能还有其他miRNA共同参与调节。Tang等^[14]在Dicer基因敲除小鼠卵泡中检测到有些mRNA和蛋白质高分度表达，说明敲除Dicer基因可减少成熟miRNA产生，可减少靶mRNA的降解和翻译抑制作用。Byrne^[15]研究发现miR-125a可靶调节Ped基因调控小鼠胚胎发育。

牦牛作为高寒地区的特有牛种，主要分布于青海、西藏、四川、甘肃和云南等高寒草原区^[16]。牦牛具有适应能力强，耐粗饲，耐寒冷等特点，从而可在含氧量低，牧草季节短，气候寒冷的条件下生存繁衍，它也是一种经济价值很高的物种，可为当地牧民提供肉、奶、皮及役力等生活生产资料。

牦牛属于单胎动物，一胎一犊且世代间隔较长的特点极大地限制了牦牛的数量，以期采用常规的遗传选择法进行优化提高双胎率进展缓慢。加大与排卵数相关主效基因的研究，这是提高繁殖性能最直接且有效的方法。目前关于GDF9和BMP15影响动物繁殖力的研究逐渐增多，但关于GDF9、BMP15在牦牛生殖过程中的研究有限。因此，本研究对牦牛GDF9、BMP15基因外显子区克隆并进行相关生物信息学分析，旨在为进一步开展牦牛GDF9、BMP15基因的研究奠定基础。

用于本研究的牦牛样品采自于甘肃省大通牦牛育种场。用常规的酚氯仿提取法提取血样中基因组DNA；利用TRizol法提取各组织中的总RNA；大肠杆菌E.coli DH5α购自TIANGEN公司；pGEM-T easy克隆载体购自Promega公司。

DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、Taq酶、IPTG和Amp均购于TIANGEN公司；TRizol Reagent购自Invitrogen公司；荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex Taq^TM II购自TaKaRa。

根据GenBank已知的牦牛GDF9（NW_005393189）和BMP15（NW_005393997）基因序列分别设计克隆引物、表达引物。根据TargetScan预测得到miRNA设计表达引物，引物（表 1）由英潍捷基贸易有限公司合成。

表 1 GDF9和BMP15基因引物序列

表选项

健康成年牦牛血液组织为材料，使用DNA提取试剂盒提取牦牛总DNA，利用紫外分光光度计测定260 nm 波长下OD值，检测浓度和纯度。

组织样品采自3头青海牦牛均为雌性，根据厂商说明利用TRizol法提取各组织中的总RNA，使用琼脂糖凝胶电泳检测其质量，Thermo公司的NanoDrop 2000检测其浓度及纯度。

根据TaKaRa反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser说明依次进行，但miRNA实时荧光定量表达研究所用反转录引物采用反转录引物混合液，各取1 μL RT primer加到78 μL ddH₂O中均匀混合用作反转录引物混合液。GDF9和BMP15基因在各组织中的表达以β-actin为内参，扩增条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，65℃ 5 s，72℃ 45 s，40个循环。bta-miR-193a-3p和bta-miR-193b表达以U6为内参基因，扩增条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，45个循环。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，利用DNA凝胶回收试剂盒回收，琼脂糖凝胶电泳检测回收物质量。再将回收产物连接pGEM-T easy载体，T4连接酶16℃过夜连接，以此构建重组质粒。将重组质粒转化感受态细胞E.coli DH5α，37℃震荡培养60 min后，涂布于含有Amp和IPTG等成分的LB 固体培养基，培养基37℃过夜培养。挑取白色阳性菌落接种于LB液体培养基过夜培养。提取质粒双酶切鉴定，将鉴定为阳性的菌落送至公司测序。

采用ExPASy（http://www.expasy.org/）等软件进行生物信息学分析，包括开放阅读框，氨基酸组成，等电点，疏水性质等理化性质，信号肽，跨膜区，磷酸化位点；运用SOPMA（http://nhjy.hzau.edu.cn/kech/swxxx/jakj/dianzi/Bioinf7/Expasy/Expasy8.htm）和SWISS-MODEL（http://www.swissmodel.expasy.org/）软件预测蛋白质的二级和三级结构。

运用Clust W软件进行多序列同源性比对，NCBI数据库分别下载GDF9和BMP15基因编码蛋白的序列，其中包括人（NP_005251.1；NP_005439.2），小鼠（XP_006532283.1；NP_0338-87.1），猪（NP_001001909.1；NP_001005155.1），山羊（NP_001272637.1；NP_001272517.1），狗（XP_005626415.1；XP_003640322.1），骆驼（XP_01097-9701.1；XP_010996367.1），黄牛（XP_010805521.1；NP_001026922.1），水牛（XP_006050617.1；XP_00-6059547.1），熊猫（XP_002912947.1；XP_0029305-52.1），狒狒（NP_001162234.1；XP_003917771.1）和牦牛共11个物种，运用MEGA5.10软件基于邻位归并法（NJ法）构建系统发生树。

运用TargetScan在线预测软件（http://www.targetscan.org/），以GDF9和BMP15基因作为靶基因，参数为系统默认，预测靶定此基因的miRNA。

以大通牦牛血液总DNA为模板扩增GDF9基因两个外显子区，PCR产物电泳结果（图 1）显示，得到两条清晰的条带，大小分别是500 bp和1 265 bp，与预期目的条带相符，测序后得到长度分别为411 bp（位于1-411 bp处）和1 082 bp（位于410-1 491 bp处）的两条核苷酸序列，拼接后得到完整外显子区序列（图 2）。运用在线BLAST比对测序得到序列与公布的GDF9 mRNA序列只有1个碱基（位于112位）的差异，相似性达99%，具有较高的同源性，初步认为得到序列是牦牛GDF9外显子区序列。

图 1 牦牛GDF9和BMP15基因PCR扩增产物的电泳图

图选项

图 2 牦牛GDF9基因编码蛋白序列

图选项

图 3 牦牛GDF9基因编码蛋白序列

图选项

以大通牦牛血液总DNA为模板扩增BMP15基因外显子区，PCR产物电泳结果（图 1）显示，得到两条清晰大小分别是450 bp和1 055 bp的片段，结果与预期相似，测序得到长度分别为323 bp（位于1-323 bp处）和802 bp（位于321-1 122 bp处）的两条核苷酸序列，拼接后得到外显子区序列如图 3。运用在线BLAST比对得到序列与公布的BMP15 mRNA序列相似性高达100%，初步认为得到序列是牦牛BMP15外显子区序列。

运用在线ExPASy 软件（http://www.expasy.org/）分析牦牛GDF9基因编码蛋白理化性质，此蛋白分子量为51.947 6 kD，理论等电点pI=8.99。含有20种氨基酸，其中Leu以11.3%最多且远高于其他氨基酸，Trp以1.5%最少。通过ORF Finder软件对所得序列进行开放阅读框分析，得到长为1 362 bp的开放阅读框，编码453个氨基酸，编码蛋白为亲水性蛋白。SignalP 4.1预测信号肽表明，该基因编码蛋白质含有一个信号肽，切割位点位于25和26位氨基酸之间。TMHMM预测无跨膜区，非跨膜蛋白。GDF9基因编码蛋白15个潜在磷酸化位点。

运用在线ExPASy 软件分析牦牛BMP15基因编码蛋白理化性质，此蛋白分子量为40.838 9 kD，理论等电点pI=9.62。含有20种氨基酸，其中Leu以11.7%最多远高于其他氨基酸，Cys和Met以1.7%最少。有长为1 119 bp的开放阅读框，编码372个氨基酸。无信号肽、跨膜区，为非跨膜蛋白。磷酸化位点预测显示，BMP15基因编码蛋白共有6个潜在磷酸化位点。

运用SOPMA在线软件预测GDF9二级结构。结果（图 4）显示，该基因编码蛋白二级结构中无规则卷曲占据最多，而β转角最少，其中α螺旋区为138个氨基酸，延伸链为76个氨基酸，β转角为23个氨基酸，无规则卷曲为216个氨基酸，分别占30.36%、16.78%、5.08%和47.68%。利用SwissModel进行同源建模预测牦牛GDF9基因编码蛋白三级结构，结果如图 5所示。

图 4 牦牛GDF9基因编码蛋白二级结构分析

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图 5 牦牛GDF9基因编码蛋白三级结构预测

图选项

运用SOPMA在线软件预测BMP15二级结构结果（图 6）显示，该基因编码蛋白二级结构与GDF9相似，其中α螺旋区为99个氨基酸占27.65%，延伸链为67个氨基酸占18.72%，β转角为29个氨基酸占8.10%，无规则卷曲为163个氨基酸占45.53%。同源建模预测牦牛BMP15基因编码蛋白三级结构，结果如图 7所示。

图 6 牦牛BMP15基因编码蛋白二级结构分析

图选项

图 7 牦牛BMP15基因编码蛋白三级结构预测

图选项

运用MEGA5.10软件基于NJ法分别构建GDF9和BMP15基因系统发生树，结果（图 8，图 9）表明，牦牛GDF9和BMP15基因均与黄牛亲缘关系最近，与水牛次之。

图 8 牦牛GDF9基因编码蛋白系统发育树（NJ法）

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图 9 牦牛BMP15基因编码蛋白系统发育树（NJ法）

图选项

采用RT-PCR技术分别对心、肾、肝、肌肉、胰、脾、卵巢和子宫等八种组织进行差异表达分析（图 10）。以GDF9在肌肉中的表达量为内对照，GDF9在卵巢和子宫中表达相对较高，在胰和脾中不表达，BMP15仅在卵巢中表达。

图 10 牦牛GDF9（A）和BMP15（B）基因在各组织 表达量

图选项

运用TargetScan在线软件预测，GDF9共预测得到28个miRNA，BMP15无结果。本研究选择属于microRNA-193家族的bta-miR-193a-3p和bta-miR-193b进行研究，采用RT-PCR技术分别对筛选得到的两个miRNA在心、脾、肺、肾和子宫5种组织进行差异表达分析，以bta-miR-193a-3p在脾中的表达量为内对照，结果见图 11。bta-miR-193a-3p整体表达量低于bta-miR-193b，但脾中表达量相对较高，且显著高于其他组织，在心、肺和子宫中均不表达。bta-miR-193b在心和肾中未检测到表达，在肺中的表达量显著低于脾和子宫中。

图 11 bta-miR-193a-3p（A）和bta-miR-193b（B）牦牛各组 织中表达量

图选项

近年来，对于GDF9和BMP15基因的研究备受关注，已有研究证明GDF9和BMP15影响羊繁殖力，其中GDF9通过旁分泌的方式影响卵泡的生长分化，而BMP15则是主要借助卵泡发育过程中抑制FSH受体在颗粒细胞中的表达来发挥调节作用，它们之间同源性较高且结构相似，功能上表现出协同效应。

本研究运用生物信息学方法预测了牦牛GDF9和BMP15基因编码蛋白的结构和功能。通过对其二级结构预测可知GDF9的α螺旋占30.36%、延伸链16.78%、β转角5.08%，无规则卷曲47.68%，BMP15的α螺旋占27.65%，延伸链18.72%，β转角8.10%，无规则卷曲45.53%，从而形成高级结构发挥其特定功能，均完成了三维建模。它们分别作为TGF-β家族中GDF 和BMP亚家族成员参与细胞生物活性的调节，因其一级和二级结构相似于家族成员，其功能也具有相似性。有研究表明转录起始位点二级结构稳定性决定翻译起始效率，稳定性越高表达率越低^[17]。而对绵羊的研究发现GDF9突变形成突变杂合体，使其表达量降低致使卵巢排卵数增加引起多胎现象^[18]。原因之一可能是牦牛二级结构不如绵羊稳定使其多胎现象少于绵羊。但牦牛GDF9和BMP15基因编码蛋白质真正的生物学功能有待于进一步研究。利用编码氨基酸序列同其他10个物种进行聚类分析并构建系统发育树，从物种之间的进化关系可看出牦牛GDF9和BMP15基因编码蛋白与黄牛最为接近，符合动物之间的分类地位。

GDF9和BMP15表达模式相似，研究初认为两者仅在卵巢中表达，经过深入研究发现不同物种之间有所区别。Fitzpatrick^[19]在对大鼠和小鼠的研究中发现GDF9仅在卵巢、睾丸和下丘脑中表达，子宫中未检测到表达，而后期在对人的研究中发现，在性腺和非性腺组织，如垂体、子宫和骨髓中也检测到GDF9的表达。Elis^[20]发现鸡BMP15在卵巢和其他组织中均有表达。Clelland^[21]对斑马鱼的研究发现，BMP15在卵巢和睾丸中高表达，而在心脏、肝脏、肌肉、肠道和脑组织中也表达。本研究检测牦牛GDF9和BMP15在各组织中表达情况，发现GDF9基因不仅在卵巢和子宫中表达，在肝脏和肌肉中也检测到表达，而BMP15仅在卵巢中表达；但GDF9和BMP15均主要在性腺组织中高表达。

miRNA在卵泡生成、排卵、卵母细胞成熟和黄体功能等方面起到重要作用^[13]。目前对于miRNA影响繁殖力的研究主要集中于对卵巢周期排卵影响。Fiedle等^[22]研究发现经过hCG处理前后的颗粒细胞，有13个miRNA差异表达，其中miR-132和miR-212经处理后表达量明显上调，后经研究确定miR-132和miR-212可通过结合寡核苷酸阻碍cAMP介导的成熟miRNA表达与功能。2010年Yao^[23]曾用TFG-β1处理小鼠腔前颗粒细胞后发现miR-224表达量明显上调，后经TFG-β超家族Ⅰ型受体抑制剂阻断效应物Smad2/3磷酸化处理后，发现上调作用减弱，表明TFG-β1/Smads通路可调节miR-224的表达，发现miR-224可通过靶定Smad4增加颗粒细胞增生和细胞雌二醇释放，而内源性miR-224的抑制能够阻碍由TFG-β1介导的颗粒细胞增生。Yao^[24]研究发现孕酮分泌过程中，经FSH处理12 h后，miR-29a和miR-30d表达量明显下降，处理48 h后表达量又显著增加。有研究表明micro-193家族成员miR-193b可通过靶定GRB7蛋白，侵袭人子宫内膜腺癌细胞系HEC-1B，抑制GRB7蛋白表达从而参与子宫内部调节^[25]。通过对micro-193家族的bta-miR-193a-3p和bta-miR-193b进行表达量分析，发现子宫作为影响产仔数的关键因素之一，bta-miR-193a-3p在子宫中无表达，在脾和肾中表达量相对较高，而bta-miR-193b在子宫中表达量较高，推测bta-miR-193b可能总用于靶定GDF9基因，为调控牦牛多胎性的miRNA。

牦牛GDF9基因克隆得到两个片段长分别411 bp和1 082 bp，共编码453个氨基酸；BMP15基因克隆得到片段长分别为323 bp和802 bp，共编码372个氨基酸，系统进化分析表明牦牛GDF9和BMP15均和黄牛亲缘关系最近，结果符合理论。

GDF9在卵巢和子宫中表达相对较高，BMP15仅在卵巢中表达。预测GDF9和BMP15的靶定miRNA，对micro-193家族的bta-miR-193a-3p和bta-miR-193b进行表达量分析发现bta-miR-193a-3p整体表达量低于bta-miR-193b，但脾中表达量相对较高，显著高于其他组织。bta-miR-193b在心和肾中未检测到表达，在肺中的表达量显著低于脾和子宫中。推测bta-miR-193b可能作用于靶定GDF9基因，参与牦牛多胎性的调控。