近年来，分子生物学和生物技术的快速发展催生了一批新型植物育种技术。与随机突变的常规育种技术相比，这些新技术更具特异性和针对性，能精确改变基因组特定位点的遗传信息，如在特定位置插入、敲除或替换DNA，以及在保持DNA序列不变的情况下控制基因的表达^[1]。与常规转基因技术相比，新技术与其有类似的特征，但严格意义上来说两者并不完全相同，如许多新技术中的转基因载体仅是瞬时出现或只出现在育种的中间过程而最终商业品种不含外源转基因元件；或者能够在指定位置导入基因，可以减少随机插入导致的不可预知的表达^[2]。欧盟及其成员国的多个重要机构和组织，如欧洲联合研究中心（JRC）、荷兰遗传修饰委员会（COGEM）、英国环境释放咨询委员会（ACRE）等，非常关注新型植物育种技术（NPBT）的发展及相应的监管问题，相继发布了一系列报告对新型植物育种技术发展应用、监管分类及风险评估等问题进行了探讨^{[3, 4, 5, 6]}。本文总结了上述报告中新型植物育种技术的研究进展及欧盟各国对于各类新型植物育种技术的监管建议，以期为我国相关工作提供参考。

目前，欧盟关注的应用前景较大的新型植物育种技术共有4大类7种技术^{[7, 8]}。

包括寡核苷酸定向诱变（ODM）和锌指核酸酶（ZFN）。这些技术可应用于位点特异的基因敲除、基因功能修饰或外源DNA的定向插入。其中，ODM可通过细胞自身的修复机制对植物基因组中靶序列进行位点特异性替换、插入或缺失。ZFN可通过非同源末端连接或同源重组方式对特异位点进行修复，使植物基因组产生碱基突变、核苷酸缺失/插入。根据其用途，ZFN又可分为两类：一类是引发特定位点特异性突变技术，如ZFN-1和ZFN-2；另一类是定向整合或替换外源基因技术，如ZFN-3。目前位点特异性诱变技术已应用于商业化育种。美国Cibus公司的基因定向诱变技术（Rapid trait development system，RTDS^TM）已被美国农业部认证为非转基因技术，该公司已利用这项技术培育出抗SU除草剂的油菜新种质；陶氏益农公司利用锌指核酸酶技术获得了耐除草剂玉米，并于2010年被美国农业部解除转基因管制审批^[9]。

包括Cisgenesis和Intragenesis。两者区别在于供体DNA来源的不同，前者的供体DNA序列包含了导入基因自身的启动子、内含子和终止子等元件；而后者为自身物种或杂交亲和物种的不同遗传元件在体外重组产生的新基因。该技术已被广泛应用于多种作物中进行特定性状改良。欧盟批准了4个新品种，如高支链淀粉马铃薯、抗晚疫病马铃薯、抗黑星病苹果和高植酸酶活性大麦进行大田试验，美国也批准了改良加工品质的马铃薯开展大田试验。此外，荷兰Avebe公司和美国辛普劳公司分别向欧盟和美国递交了解除高支链淀粉马铃薯Modena和低丙烯酰胺马铃薯的转基因监管申请^[10]。

包括RNA介导的DNA甲基化（RdDM）和反向育种。这些技术仅在育种中间过程涉及转基因技术，转入的外源基因在进一步的选育中被剔除，最终商业品种中不含任何遗传修饰相关的DNA序列。其中，RdDM主要通过转入与目标基因启动子区域同源的RNA编码基因，诱导靶基因启动子区域的甲基化，并通过抑制靶基因的转录引发基因沉默。反向育种技术是利用RNAi技术抑制植物减数分裂重组快速获取纯合亲本系，以保持植物杂种优势的稳定遗传。目前，RdDM技术主要应用于烟草、拟南芥等模式植物和水稻、玉米、马铃薯等作物相关基因的修饰和调控研究。反向育种技术相关的研究报道较少，主要应用于模式植物拟南芥的研究中，在作物中的应用仍处于基础研究阶段^[3]。

包括农杆菌浸润和转基因砧木嫁接。农杆菌浸润技术又可分为狭义的农杆菌浸润和农杆菌注射，前者是将叶片浸润于非复制型载体的农杆菌悬浮液中，以研究局部的基因定位表达；后者主要将叶片浸润于含有病毒载体的农杆菌悬浮液中，以研究目标基因在整个植株中的表达和扩散。转基因砧木嫁接技术是将非转基因接穗嫁接在具有改良特性（如根系能力改善、抗土传病害）的转基因砧木上，以改良作物的特定性状。目前，农杆菌浸润技术主要应用于模式植物烟草的基础研究，也有公司利用该技术研究如马铃薯、油菜和莴苣等作物。转基因砧木嫁接技术主要应用于果树、蔬菜等作物育种中，相关品种目前在欧盟申请了大田试验，分别为增强生根力的苹果和梨、抗扇叶病的葡萄、抗疫病的柑橘以及改善株型的枳橙^[3]。

文献是反映科技发展趋势的重要载体，科技文献数量和结构的变化能够客观反映相应的科学技术领域的发展特征^[11]。本文利用新型植物育种技术相关的关键词^[3]从ISI Web of Science数据库对欧盟各国发表的论文进行检索，共得到541篇文献（论文检索时间为2015年5月）。其中，7种新型植物育种技术在欧盟均有研究，尤其在2000年以后相关文献数量呈快速增长趋势，说明该领域的研究活动逐渐活跃（图 1）。从时间上看，2000年前出现的较早技术依次为农杆菌浸润、ODM、转基因砧木嫁接和RdDM；2004年以后出现的新技术分别为同源转基因技术、ZFN和反向育种技术。从每年的文献数量看，农杆菌浸润技术和RdDM为欧盟研究使用频率较高的技术；ZFN是近年来较活跃的新技术。

图 1 1986-2015年欧盟新型植物育种技术论文的时间分布 Fig. 1 The Research and Regulatory Status of Novel Plant Breeding Techniques in Europe

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表 1中显示了欧盟新型植物育种技术论文数量排名前10的国家。从发文数量看，排名前5的国家分别为德国、英国、法国、荷兰和西班牙，并且德、英和法等国家的研究几乎涵盖了7种技术。从技术种类看，RdDM和农杆菌浸润等技术在排名前10的国家中均有分布；同源转基因技术为荷兰的优势技术；ZFN和ODM的研究主要集中在德国；反向育种技术为研究使用最少的技术。

表 1 新型植物育种技术论文排名前10的欧盟成员国分布情况/篇 Tab. 1 The Research and Regulatory Status of Novel Plant Breeding Techniques in Europe

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对欧盟各国研究机构的分析表明，发文量排名前5的机构分别为荷兰瓦赫宁根大学、法国国家农业科学院（INRA）、英国John Innes Centre（JIC）、奥地利科学院和德国马普研究所。其中，瓦赫宁根大学的研究主要涉及了同源转基因和农杆菌浸润技术；法国国家农业科学院（INRA）的研究覆盖了7种新技术；英国JIC和奥地利科学院等机构的研究分别较多涉及了农杆菌浸润和RdDM技术（表 2）。

表 2 新型植物育种技术论文排名前10的欧盟研究机构分布情况 Tab. 2 The Research and Regulatory Status of Novel Plant Breeding Techniques in Europe

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随着技术的发展，新型植物育种技术与常规转基因技术之间的界限越来越模糊，对转基因生物（GMO）法律解释的不同理解会使新型植物育种技术产品产生不同的分类结果（转基因或非转基因）。此外，对于新技术作物在立法、定义和监管方法等方面的差异，还会导致监管方法的不统一和这些作物及相关市场贸易发展的不同步。因此，欧盟及其成员国纷纷围绕新型植物育种技术作物是否符合欧盟2001/18/EC指令中GMO的法律解释等问题展开了深入探讨。

JRC邀请了阿根廷、澳大利亚、加拿大、日本、南非和美国等国专家参与讨论对于新型植物育种技术的管理和立法^[12]；英国ACRE从3个角度对新育种技术相关产品是否属于GMO进行了分析，包括是否使用转基因技术、中间产品是否属于GMO、后代是否为GMO^[4]；德国栽培作物研究中心（JKI）和荷兰COGEM等机构分别组织专家讨论相关问题^{[13, 14, 15, 16]}。但因新技术的多样性和作用方式的复杂性以及研究进展的不同步等因素，各机构无法获得完全相同的结论。目前多数观点认为同源转基因、ZFN-3、转基因砧木等技术获得的含有重组DNA的植株及后代需要监管；ODM、ZFN-1、反向育种等技术产生的后代为非转基因生物；RdDM则需根据其是否改变植物基因组DNA做判断；转基因砧木嫁接技术需区分砧木与后代的监管；农杆菌浸润技术视具体情况而定，无重组DNA的后代无需监管（表 3）。

由于新型植物育种技术出现和发展的时间较短，目前对于新型植物育种技术是否对人类健康和环境存在潜在风险还不清楚（或者认识还不一致），因此是否和如何评估新技术的潜在风险成为欧盟关注的重点之一。有观点认为，用于转基因作物风险评估的法规和原则也适用于评估新型植物育种技术的潜在风险^[2]；但也有观点认为，风险评估必须基于证据基础，关注性状和产品而不是技术本身，应根据新技术的各自特点进行评估，并且需要将最终产品与中间品系区别对待^{[1, 6, 17, 18, 19]}。

COGEM认为反向育种技术的产品与常规育种产品一样安全而无需进行风险分析；对于农杆菌浸润技术，需要了解农杆菌浸染植株后代有关的风险；对于RdDM，无法根据现有知识对其风险进行评估；对于转基因砧木嫁接技术，建议根据公认的方法对其环境风险进行评价；对于ODM，认为其比非定向诱变的风险更低^[5]。欧洲食品安全局（EFSA）对同源转基因技术和ZFN-3技术的安全性评估结果认为，欧盟现有转基因生物风险评估指导条例适用于上述新技术及其产品的风险评估；其中，Cisgenesis与常规育种技术的风险程度相当，Intragenesis和常规转基因技术均可能造成新风险；ZFN-3技术比常规转基因技术具有更小的风险^{[20, 21]}。奥地利卫生及食品安全局也对同源转基因技术开展了风险评估，并获得了与EFSA相似的结论^[22]。

我国新型植物育种技术发展迅速，已将定点诱变、同源转基因、转基因砧木嫁接等多种新技术陆续应用于基础研究中^{[23, 24, 25, 26, 27]}。随着这些新技术及其成果在育种中的应用，在不久的将来我国也会面临监管制度无法适应技术发展的问题。虽然我国在《农业转基因生物安全管理条例》中将农业转基因生物确定为“利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或者农产品加工的动植物、微生物及其产品”，但该规定对于“新型育种技术及产品是否属于转基因生物”等问题没有明确规定。因此，新型植物育种技术及产品是否需要监管以及如何监管等问题应引起我国政府的重视。为此建议国家相关部门积极应对、未雨绸缪，组织相关专家开展研讨以明确其法律地位，最终促进这些新技术的快速发展与合理应用，这对于保障国家粮食安全和我国农业产业的可持续发展具有重要战略意义和实用价值。