睾丸是雄性动物的主要生殖器官，具有产生精子、分泌雄激素等功能。精子发生即精子形态的变化，该过程是在睾丸曲精细管内进行的，包括精原干细胞的增殖和分化、精母细胞的减数分裂、精子形成和精子释放等过程^[1]。睾丸内分泌水平变化主要指雄激素的变化，雄激素由睾丸间质细胞产生，对维持精子发生和副性腺发育作用重大。精子发生和雄激素分泌相互作用，共同影响雄性动物生殖生理过程。目前，对雄性生殖生理的研究主要集中在精液品质测定、睾丸组织学、睾丸组织基因的克隆与表达以及睾丸中激素分泌水平等^[2-5]。这些研究只能反映睾丸组织形态结构和基因、转录水平，而不能反映蛋白质翻译水平、翻译后的修饰以及蛋白质间的相互作用等多个水平上的调控。因此，从蛋白质水平研究睾丸发育、雄性生殖疾病和睾丸应对刺激等具有十分重要的意义。

1 定量蛋白质组学及技术手段

蛋白质组（proteome）的概念是1994年澳大利亚的两位学者首先提出的，指生物体中所有蛋白质的组成和活动方式^[6]。由于生物体中大多数活动是动态的，蛋白质组研究并不能完全了解蛋白质对生物体的功能。随着后基因组时代的到来，研究人员提出了蛋白质组学（proteomics）的概念。蛋白质组学指从整体水平上研究机体或细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平及翻译后的修饰，进而研究蛋白质之间的相互作用。

定量蛋白质组学（quantitative proteomics）是对生物体复杂组织或体液中所有蛋白质进行鉴定，并对蛋白质的量及量的变化进行准确的测定。根据技术手段不同，将定量蛋白质组学分为基于凝胶和质谱两大类，共5种不同方法，即双向电泳法（two-dimensional electrophoresis，2-DE）、荧光差异凝胶电泳（differential in-gel electrophoresis，DIGE）、非标记定量蛋白质组学（lable free）、标记定量蛋白质组/稳定同位素标记技术（isobaric tags for relative and absolute quantitation/Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，iTRAQ/SILAC）和质谱选择反应监测/多反应监测技术（selective reaction monitoring/Multi reaction monitoring，SRM/MRM）。这些方法各具优缺点（表 1），可根据需要选择合适的方法。定量蛋白质组学技术已经在动物疾病、动物发育、肉品质、乳品质和蛋品质等畜牧兽医研究中广泛应用^[7-11]，但有关睾丸蛋白质组学的研究相对较少。因此，深入了解和阐明睾丸发育、病理状态下及应激状态下蛋白质的变化至关重要。

定量蛋白质组学研究主要依赖于蛋白质分离、质谱和生物信息学这三大技术。蛋白质分离技术中的2-DE技术是O’Farrell’s于1975年首次提出并建立，也是目前最常使用的技术^[12-14]。但是2-DE技术存在重复性差、灵敏度低和耗时长等缺点。针对这些缺点，后来发展起来的DIGE、Lable free、iTRAQ/SILAC和SRM/MRM等技术重复性好、操作简单和劳动强度小。质谱技术的出现为蛋白质鉴定起到了支撑作用^{[15, 16]}。目前质谱技术主要有点喷雾离子化质谱（electrospray ionization-mass spectrometry，ESI-MS）和基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser-desorption ionization-mass spectrometry，MAL-DI-MS）。这2种技术具有高灵敏度、高通量和高质量的检测范围，从一定程度上促进了蛋白质组学的发展^[17]。蛋白质生物信息学分析主要包括数据库的查阅和生物信息学软件在蛋白质组学研究中的应用。其中，GO分析（gene ontology）、通路分析（KEGG pathway）和蛋白质相互作用分析（STRING network）是目前蛋白质组学研究中最常用的生物信息学分析方法。

2 定量蛋白质组学在动物睾丸发育研究中的应用

对于雄性动物而言，睾丸的正常结构和正常生理机能是繁殖活动的基础。随着蛋白质组学的出现，研究人员将其应用到睾丸发育的研究中，并为睾丸发育的研究提供可靠的技术支撑，1997年，Cossio等^[18]首次应用2-DE技术分离了大鼠（Rattus norve-gicus）睾丸的蛋白质，之后Witzmann等^[19]应用同样的方法分离了牛（Bos taurus）睾丸的蛋白质，二者均只得到了一张蛋白质分布图，没有对其进行质谱鉴定和生物信息学分析。2003年，朱叶飞等^[20]应用2-DE和质谱技术对成年雄性小鼠（Mus mus-culus）睾丸总蛋白质进行研究，从图谱中共分离出1 621个蛋白点，成功鉴定出血清白蛋白和蛋白质二硫化物异构酶2种蛋白质，虽然鉴定出的蛋白质较少，但是肯定了蛋白质组学技术在动物睾丸发育研究中的可行性。Huang等^[21]应用2-DE技术对1岁左右的杜洛克公猪（Sus scrofa）睾丸蛋白质进行研究，通过质谱鉴定出447个蛋白点对应于337种蛋白质并提交于NCBI数据库，为猪睾丸发育生物学和病理学研究提供了重要理论数据。Paz等^[22]应用2-DE技术研究了第8、18、45日龄小鼠睾丸蛋白质表达的差异，3个发育阶段的睾丸蛋白质存在显著变化，最终鉴定出44种蛋白质，这些蛋白质主要与抗氧化和氧化还原反应相关，主要包括脂类和碳水化合物代谢等途径。同年霍然^[23]应用2-DE技术首次研究了正常人（Homo sapiens）睾丸的蛋白质组成并建立了人睾丸蛋白质数据库，之后通过质谱技术成功鉴定出541种蛋白质，生物信息学分析发现80%的蛋白质参与了代谢过程，并发现糖酵解通路和精氨酸代谢通路对睾丸发育具有重要作用。Li等^[24]利用同样的方法进一步对已证明可育的正常人睾丸蛋白质组成进行分析，从1 920个蛋白点中发现725种特殊蛋白质，并建立了相应的抗体库。其中240种蛋白为精液蛋白，167种蛋白存在于成熟精子中。利用免疫组织化学方法对319种精子蛋白或精子附着蛋白进行定位，47%的蛋白为精子固有蛋白，23%蛋白为外部蛋白，可能源于附睾或成熟过程中蛋白的黏附。尽管525种精液蛋白中有408种蛋白已被鉴定为附睾丰富表达蛋白，但其余的22%的蛋白更像是睾丸蛋白而非附睾蛋白。对精液、睾丸、精子和精子黏着蛋白的鉴定，有利于加深对精子成熟过程产物以及功能形成的探索。Huang等^[25]探讨了猪出生后睾丸发育不同阶段蛋白质表达的差异，选取1周、3月龄和12月龄的杜洛克公猪各4头，通过2-DE技术分析共得到264个蛋白点，其中108个蛋白点在不同发育阶段存在显著差异，最终鉴定出90种蛋白质。这些蛋白质的表达水平随年龄增加而增加的占36.1%、随年龄增加而降低的占38%。之后对这些差异蛋白质进行GO分析发现25%的蛋白质参与细胞组成，22%的蛋白质参与代谢过程。2015年卢曾奎等^[26]进行了有关绵羊（Ovine）睾丸蛋白质组学的研究，建立并优化了绵羊睾丸蛋白质2-DE图谱。后续通过2-DE技术研究不同发育期绵羊睾丸差异蛋白质组成，共得到37种在5个发育期均存在差异的蛋白质。GO分析发现12个蛋白质参与生长发育过程，2个蛋白质参与繁殖过程。这些差异蛋白质的发现，将有助于公羊生长和繁殖性能的研究。

3 定量蛋白质组学在动物睾丸疾病研究中的应用

定量蛋白质组学可以分析比较不同病理状态下蛋白质的变化，从而鉴定出疾病状态下发生变化的蛋白质，为疾病诊断和治疗提供理论依据。2007年，蒋荣江等^[27]研究了正常大鼠与尿道下裂大鼠睾丸差异蛋白质的表达，从2-DE图谱中共发现9个差异蛋白点，其中4个在正常大鼠睾丸中高表达，5个在尿道下裂大鼠睾丸中高表达，为进一步鉴定尿道下裂发生的蛋白质奠定基础。Huo等^[28]对3名正常和3名无精症病人的睾丸组织进行蛋白质组成的比较分析，发现10个蛋白点在正常人与无精症病人睾丸中存在显著差异，这些蛋白点被鉴定为Prx4（peroxiredoxin-4）、Prx2（peroxiredoxin-2）、HSP27（heat shock proteins27）、CTSD（cathepsin D）、GPX4（phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase 4）等，代谢通路分析发现Prx2、HSP27、CTSD和GPX4这4种蛋白与睾丸细胞增殖、凋亡相关。李飞等^[29]建立并优化了成年无精症男性睾丸2-DE图谱，为无精症发病机制从蛋白质组学水平上的研究提供思路。

4 定量蛋白质组学在特殊环境刺激下动物睾丸研究中的应用

动物时刻面临着各种特殊环境刺激，包括金属元素、微波辐射、有毒物质及温度变化等。这些特殊环境刺激会对动物的生殖系统造成一定的危害，但是目前对于动物如何应对和适应这些特殊环境刺激的分子机制尚不明确。因此应用定量蛋白质组学技术比较特殊环境刺激前后动物生殖系统中蛋白质的变化，将有助于了解动物如何应对和适应这些特殊环境刺激的分子机制。2005年，张建鹏等^[30]探讨了金属元素镉对大鼠睾丸的毒性机制，通过2-DE技术比较了生理盐水对照组、镉处理组和镉加维生素C处理组之间的差异发现，16个蛋白点发生变化，其中8种蛋白质可能与睾丸镉中毒机制有关，同时发现添加维生素C对镉中毒有减缓作用。陈浩宇等^[31]研究了微波辐射对大鼠睾丸蛋白质表达的影响，微波辐射72 h后的大鼠睾丸2-DE图谱与正常情况相比共有136个蛋白点发生变化，发生变化的蛋白质参与了睾丸细胞骨架组成、能量代谢、信号转导等过程，微波辐射可导致睾丸蛋白质表达的改变，进而影响精子的生成。Ma等^[32]应用2-DE技术检测了低剂量的四氯双苯环二恶英（2，3，7，8-Detrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）对大鼠睾丸和精子蛋白质的影响，将32只雄性大鼠随机分成3组，分别饲喂140、350和875 ng TCDD/kg/周，29周后发现TCDD对睾丸蛋白质的表达以及精子数的改变与饲喂玉米油的对照组有显著差异，质谱鉴定后发现随着TCDD饲喂量的增加PERF15蛋白表达量呈下降趋势，而SSP411、泛素羧基末端水解酶-3和真核翻译延伸因子-1蛋白表达量呈增加趋势，这些数据为研究TCDD对睾丸毒性机制奠定理论基础。赵珺^[33]研究了高温热应激对雄性小鼠生殖机能的影响，通过比较正常组与高温组的2-DE图谱共发现18个差异蛋白点，质谱鉴定出16种蛋白质，这些蛋白质主要包括DNA损伤修复蛋白、热应激蛋白、细胞周期蛋白和细胞凋亡蛋白等。黄礼元^[34]应用2-DE技术研究了香烟烟雾对小鼠睾丸蛋白质表达的影响，通过质谱分析共得到35种差异蛋白质，其中PEBP蛋白（phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP）可能与精子发生相关，可作为临床上评估吸烟对生殖不良影响的分子标记。Li等^[35]应用2-DE技术探讨了碳离子辐射对青春期小鼠睾丸蛋白质表达的差异，通过质谱鉴定出8种蛋白质，这些蛋白质主要参与能量供给、细胞增殖和抗氧化等功能，对睾丸响应碳离子毒性的研究起重要作用。

5 展望

定量蛋白质组学为睾丸发育、雄性生殖疾病以及应对刺激的研究提供了新的思路和技术手段。目前，定量蛋白质组学虽然在睾丸的研究中取得了一些成果，但仍然存在一些问题尚未解决，如（1）2-DE技术作为首选方法，重复性差、鉴定蛋白质数目有限、容易受外界因素影响等，而其他方法较昂贵；（2）研究者缺乏生物信息学知识，数据分析不够深入；（3）睾丸定量蛋白质组学与其他组学联合分析不够。针对以上不足，睾丸定量蛋白质组学有必要在以下3个方面进行深入研究：（1）开发较便宜蛋白质定量技术，快速、大通量检测差异表达蛋白质；（2）加强对差异蛋白质的生物信息学分析，达到对实验数据信息的最大挖掘；（3）联合应用睾丸基因组学数据库、转录组学数据库、代谢组学数据库和蛋白质组学数据库，综合分析睾丸发育、雄性生殖疾病以及应对刺激的机制。相信随着测序技术的快速发展和生物信息学分析技术的不断进步，睾丸定量蛋白质组学在如何提高动物繁殖力、提高雄性动物生殖疾病的治疗效率以及更好地适应环境等方面的研究将获得重大进展。