阳光充足是提高木薯产量的重要保证。作为短日照热带作物，木薯喜阳不耐遮荫，它对光照强度十分敏感。在拉丁美洲、非洲等热带干旱或半干旱地区，农民以求达到土壤经济效益最大化，木薯常常与其它早熟的作物（如玉米、水稻、橡胶和椰子树等）间作在一起[1, 2]。大多数时候，特别是植物生长发育的早期，由于间种的作物长得较快，致使木薯经常遭受到不同程度的遮荫，光照强度降低[3]；其次，随着木薯栽培水平的提高，木薯生产区域的扩展和种植密度的增加，使得遮荫的情况也时有发生。遮荫（光照不足）会导致木薯茎叶陡长、节间伸长、茎干细弱、块根变小，最终造成木薯产量显著减少[3]。因此，筛选和鉴定与木薯遮荫相关的重要基因，深入研究其生物学功能，对提高木薯产量具有重要意义。
在遮荫条件下，光强和光质是改变最大的环境因子：如远红光（FR）增加，红光（R）和蓝光减少[4]，它们可以作为信号分子诱导植物发生一系列的生理变化。相应地，许多基因的表达量也会发生改变。其中，PIF3-LIKE 1（PIL1）是遮荫条件下加速植物生长所必需的基因之一，编码一个bHLH蛋白[5]。PIL1最早是在拟南芥中通过基因芯片发现的，qRT-PCR证实其表达量在遮荫环境（低R：FR）下可以迅速被诱导；更重要的是，当植物从低R：FR转移到高R：FR时，其表达量则迅速下降[5]。研究表明，PIL1可以被其他基因（如cry1、cry2、pif4、pif5、pif7等）调控[6, 7]，共同参与遮荫反应。而且，PIL1还能自我反馈调节（自身的表达量）以应对遮荫胁迫[8]。
木薯栽培种是野生种从热带雨林边缘向稀树草原进化而来[9]。经过约7 000-12 000年的驯化，与野生种相比，木薯栽培种具有更好的逆境（如抗病性、耐旱性和耐贫瘠）耐受能力，因而具有更高的生物量和淀粉产量[10]。PIL1被看作是研究植物遮荫反应的标记基因[11]。然而，目前与PIL1相关的研究主要集中在模式植物拟南芥，PIL1在热带作物中的研究还较少，有关木薯PIL1基因克隆及其对遮荫反应的相关分子作用机制尚未见报道。本研究从木薯栽培种Ku50叶片中克隆一个PIL1基因（命名为MePIL1），从系统进化树、基因结构变异、启动子顺式元件和基因表达等方面对它展开了分析，为进一步研究MePIL1的调控功能奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料供试木薯野生种W14、栽培种Ku50和Arg7由中国热带农业科学院热带生物技术研究所提供。
1.2 方法 1.2.1 材料种植与处理在木薯种植季节，将Ku50种茎切成长度约15 cm的茎段，挑选芽眼（3-4个/茎段）且粗细均匀一致的茎段扦插于塑料盆（高18.8 cm，上直径18.5 cm，下直径14.8 cm）中，1茎段/盆。基质采用营养土与蛭石以1:1的体积比进行混合。木薯种植约10 d后进行间苗，保留1苗/盆。
遮荫处理：遮荫处理的木薯种植于树荫底下，对照处理的木薯种植于室外。种植约2个月后，选择生长状况较一致的植株，收集不同叶片，包括未展开叶、第一片完全展开叶和老叶的样品，-80℃超低温冰箱保存。
PEG处理：种植60 d后，选取长势一致的植株用20%的PEG6000溶液模拟干旱胁迫，以浇灌自来水（不施PEG）为对照。在处理0、3和24 h后，分别收集叶片（包括未展开叶、第一片完全展开叶及老叶）和根的样品，-80℃超低温冰箱保存。
为了考察木薯野生种（W14）和不同栽培种（Ku50和Arg7）中MePIL1基因的表达变化，我们收集了正常大田种植环境下叶片（90 d）、茎（90 d）和储藏根（150 d）的样品，-80℃超低温冰箱保存、备用。
1.2.2 RNA提取与cDNA合成用RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取不同木薯组织总RNA。用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司）将总RNA反转录成cDNA，储存于-20℃备用。
1.2.3 基因克隆以木薯Ku50叶片的cDNA第一链为模板，用primer6.0软件设计的MePIL1基因全长扩增引物（L1：5’-CAATCGGGTCGTGTTTTGGC-3’；R1：5’-TCTTTGAGCCTATGGCGTGT-3’）进行PCR扩增。PCR产物经回收、连接和转化后，挑选阳性TA克隆送往华大基因生物科技公司进行测序。
1.2.4 生物信息学分析用BLASTP搜索Phytozome数据库（https://phytozome.jgi.doe.gov/），获取在其他物种中同源性较高的序列；用ClustalX进行序列比对；用MEGA5.2软件[12]构建进化树（Bootstrap=1 000）；用DnaSPv5[13]进行SNP分析及Ka/Ks计算；用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行启动子元件分析；用CDD数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）进行保守结构域分析。木薯栽培种Ku50和野生种W14中MePIL1基因序列由前期全基因组测序确定[9]；栽培种AM560中MePIL1序列从Phytozome数据库下载。
1.2.5 基因表达分析用primer6.0软件设计MePIL1基因qRT-PCR特异性引物（L2：5’-TGACTTGTTTC-CCGGTTCGT-3’；R2：5’-CGTCTTCGCATTCGGGTA-CT-3’）。actin基因引物（L3：5’-TGATGAGTCTGG-TCCATCCA-3’；R3：5’-CCTCCTACGACCCAATCT-CA-3’）由前人研究[14]确定。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR采用SYBR Green I试剂盒（TaKaRa公司），按照操作说明在Mx 3005P荧光定量PCR仪（Stratagene，美国）上进行：95℃ 30 s，1个循环；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环；95℃ 1 min，55℃ 30 s，95℃ 30 s，1个循环。每个样品3次生物学重复，表达量按照2-ΔΔCt进行计算[15]。
2 结果 2.1 MePIL1基因的克隆根据拟南芥AtPIL1序列（AT2G46970），搜索木薯数据库寻找其同源序列（Manes.05G008000.1），之后设计基因特异性引物进行PCR扩增（图 1）。测序后得到一个长为1 639 bp的序列，包括33 bp的5’ UTR，28 bp的3’ UTR及1 578 bp的开放阅读框，将其命名为MePIL1（GenBank登录号：KX147466）。MePIL1编码525个氨基酸。经与木薯参考基因组（https://phytozome.jgi.doe.gov/）比对，MePIL1共有5个外显子，4个内含子（图 2）。保守结构域分析表明，MePIL1包含一个HLH domain，位于第3、4外显子上（图 2）。
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| 图 1 木薯MePIL1基因扩增结果 M：D15000+2000 DNA marker；1：PCR扩增产物 |
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| 图 2 木薯MePIL1基因比对结果（A）与其结构变异示意图（B） |
为了揭示MePIL1基因结构的变异，将3个木薯品种（包括一个野生种W14，两个栽培种Ku50和AM560）中的MePIL1序列进行比对分析（图 2-A），共发现46个SNP，4个Indel（图 2-B）。整体上，这些变异分布比较均匀。有趣的是，在HLH保守结构域并没有发现任何变异，暗示HLH区域可能对MePIL1基因功能非常重要。
序列两两比较表明，MePIL1的结构变异主要来自于栽培种与野生种之间的差异：栽培种与栽培种之间的差异很小，只有4个SNP，其中1个在非编码区，3个在编码区；除此之外，其他变异均来自于栽培种与野生种之间。栽培种与野生种Ka/Ks的值介于0.519-0.578之间，暗示MePIL1基因在进化的过程中受到了纯化选择。
2.3 MePIL1进化树分析经Phytozome数据库搜索，获得了与MePIL1同源性较高的其他物种的序列。进化树分析表明，MePIL1蛋白与杨树（Potri.014G111400.1）和杞柳（SapurV1A.0321s0050.1）聚在一起，亲缘关系较近（图 3）。此外，我们还发现，C4植物包括柳枝稷、谷子、高粱、二穗短柄草、玉米和狗尾草聚在一起，而C3植物如白菜型油菜和水稻聚在一起，说明PIL1基因具有C3-C4分化的特性。然而，作为C3植物，拟南芥并没有与白菜型油菜和水稻聚在一起，说明PIL1在C3植物内存在不同的分化。
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| 图 3 MePIL1系统进化树分析 |
启动子是基因的一个重要组成部分。我们选取MePIL1起始密码子上游1 500 bp进行启动子元件分析，发现了与ABA作用的元件（如ABRE）、与光相关的元件（如ATCT-motif、Box I和Box 4）、与热胁迫相关的元件（如HSE）和与干旱诱导相关的元件（如MBS）。而且，这些作用元件在野生种和栽培种中都存在。这些结果表明，MePIL1可能参与干旱、光、热等胁迫的响应。
2.5 MePIL1表达分析本研究考察了MePIL1基因在野生种和栽培种不同组织中的表达量变化。结果（图 4-A）表明，在野生种W14中，MePIL1在叶片中表达最高，茎秆其次，根中最低。与野生种相比，MePIL1在栽培种中呈现出相似的表达趋势，然而其在叶片中的表达量要高3-4倍，且表现出叶片特异性表达的特点。这些结果表明，在木薯进化的过程中，MePIL1基因主要倾向于通过提高叶片中的表达量来适应新的生长环境。这可能与该基因在野生种和栽培种之间的碱基变异有关。
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| 图 4 木薯MePIL1基因表达量分析 A：MePIL1在不同组织中的表达。B：MePIL1在遮荫胁迫处理下的表达。C：MePIL1在PEG 6000胁迫处理下的表达。FL：未展开叶；FEL：第一片完全展开叶；BL：老叶；RT：根；0、3、24分别表示PEG6000处理后0、3和24 h |
木薯栽培种是野生种从热带雨林边缘向稀树草原进化而来，其中光（包括光强和光质）是最重要的环境因子。随后，我们在正常和遮荫条件下，分别检测了栽培种Ku50不同叶片中MePIL1基因的表达量。结果（图 4-B）表明，MePIL1在遮荫条件下的表达量均显著的高于其在正常条件下的表达量，说明该基因受遮荫胁迫诱导。此外，我们还发现，MePIL1的表达量随着叶片衰老而逐渐增加，暗示该基因可能还参与木薯叶片衰老过程。
在MePIL1启动子区域，我们发现了与ABA作用的元件（如ABRE）和与干旱诱导相关的元件（如MBS），暗示MePIL1可能还参与干旱胁迫。为了初步研究MePIL1对干旱胁迫的响应，我们在PEG 6000模拟条件下，考察了MePIL1在不同组织中表达的动态变化（图 4-C）。结果表明，在未展开叶中，MePIL1的表达量呈现先下降（3 h）再上升（24 h）的趋势；在第一片完全展开叶中，MePIL1的表达量呈现逐渐上升的趋势，但差异并不明显；在老叶中，MePIL1的表达量在PEG胁迫3 h后基本没有变化，但在24 h显著上升；在根中，MePIL1的表达量很低，呈现先上升后下降的趋势。这些结果表明，在PEG胁迫处理后，MePIL1在不同叶片和根中的表达量呈现多样性的变化，这将为后续研究其功能提供较好的参考。
3 讨论木薯是喜阳作物，光照不足（遮荫）显著地减少了木薯产量。作为遮荫反应的标记基因，PIL1在植物遮荫胁迫中扮演着重要角色，但在木薯中尚未见报道。本研究从木薯中克隆了PIL1的同源基因MePIL1。序列分析表明，MePIL1编码525个氨基酸，有5个外显子，4个内含子，亲缘关系与杨树和杞柳较近。与其他PIL1基因类似[5]，MePIL1也含有一个保守的HLH结构域。
木薯栽培种是野生种从热带雨林边缘向稀树草原进化而来[9]。与热带雨林相比，稀树草原所处的纬度更高，太阳光要相对弱一些。为了更好地适应新的生长环境，许多与光、高温和水分胁迫等相关的基因在栽培种中的表达均较高[9]。在本研究中，我们发现MePIL1在两个栽培种（Ku50和Arg7）叶片中的表达量均显著高于野生种，暗示这可能是木薯在进化的过程中增强环境适应性的结果。此外，我们还发现MePIL1在野生种和栽培种之间存在大量的碱基变异，但具体哪个变异与基因的表达量相关，目前还不清楚。
与预期相同，在遮荫条件下，MePIL1的表达量被显著诱导。而且，它还能被PEG6000处理诱导，说明MePIL1可能参与除遮荫之外的其他胁迫（如干旱）响应。这一点在水稻中观察到了相似的结论：在干旱条件下，OsPIL1可以作为一个关键调控因子参与节间伸长[16]。除此之外，冷胁迫也显著抑制了OsPIL1的表达量，然而高盐、高温、ABA、GA对OsPIL1的表达量没有影响[16]。
表达分析表明，MePIL1在叶片中特异性表达，而且其表达量随着叶片衰老而逐渐增加，暗示该基因可能参与木薯叶片衰老过程。虽然目前还没有PIL1参与衰老的直接报道，但有研究表明，PIF4和PIF5在拟南芥中能诱导叶片衰老[17]；而且PIF4和PIF5能调控其下游靶基因PIL1的表达[18]，暗示PIF4和PIF5可能通过PIL1调控木薯叶片衰老。这些结果为进一步研究MePIL1的功能奠定了基础。
4 结论本研究克隆了木薯PIL基因MePIL1。该基因具有1 578 bp的开放阅读框，编码525个氨基酸，含有HLH保守结构域。系统进化树分析表明，MePIL1与杨树和杞柳的亲缘关系较近。基因结构变异分析显示MePIL1在HLH结构域非常保守，其结构变异主要来自于栽培种与野生种之间的差异。表达分析结果显示，MePIL1在叶片中高表达，而且其表达量受到遮荫和渗透胁迫的诱导。
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