水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. Oryzae，Xoo）菌株PXO99A的clp基因（基因组序号：PXO_04006）编码产物蛋白Clpxoo（CRP-like protein）作为一种信号受体和全局性转录调控因子，在Xoo毒性表达上发挥着重要的作用[1]。当clp基因缺失后，Δclp突变体的致病力、运动性、胞外多糖产生能力和对H2O2的抗性都显著降低[2, 3]。Clpxoo含有两个保守的结构域，N端为cNMP的结合结构域，其可以作为第二信使环二鸟苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP）信号受体结构域，C端为保守的DNA结合结构域（HTH），HTH可以识别和结合下游靶基因[4, 5]。
c-di-GMP作为一种新型的第二信使，可以通过改变结构与受体蛋白结合而发挥作用，从而调控细胞生物膜形成、运动性和毒性因子表达等诸多生物学功能[6-11]。在Xoo中，Clpxoo作为c-di-GMP信号受体，通过与c-di-GMP的结合介导c-di-GMP信号途径，并调控生理生化功能。但是Clpxoo调控Xoo基因表达的机理并不完全清楚。通过对野油菜黄单胞菌（X. campestris pv. campestris，Xcc）Clpxcc晶体结构分析和等温滴定量热法（ITC）等试验研究，发现Clpxcc蛋白第70位天冬氨酸位点D70或第166位精氨酸位点R166定点突变成丙氨酸A后，Clpxcc与c-di-GMP结合的能力显著降低[12]。Clpxcc的cNMP结构域中谷氨酸E99也是Clpxcc结合c-di-GMP的关键氨基酸，当第99位谷氨酸位点E99突变成丝氨酸S时，Clpxcc大大降低了对胞外c-di-GMP浓度变化的敏感性[13]。而通过序列同源性分析，发现Xoo和Xcc中的Clp蛋白具有很高的同源性，其中D70、R166和E99更是高度保守。因此，本研究也同样选择了转录调控蛋白Clpxoo中的3个氨基酸位点做下一步研究。
为了进一步阐明Clpxoo在Xoo中的调控作用机制，以及c-di-GMP对Clpxoo的调控作用的影响，本研究构建Clpxoo的3个点突变体；用优化的条件原核诱导表达和纯化点突变蛋白；利用ITC试验检测Clpxoo点突变蛋白与c-di-GMP结合情况，旨在确定Clpxoo蛋白缺失的氨基酸位点是否为Clpxoo和c-di-GMP结合的关键功能位点。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试菌株、质粒及培养条件Xoo菌株PXO-99A由本实验室保存；大肠杆菌（Escherichia coil，E. coli）DH5α和BL21（TIANGEN）。Xoo培养基：PSA固体培养基（蛋白胨10 g/L，蔗糖10 g/L，谷氨酸1 g/L，琼脂粉15 g/L）；M210液体培养基（酶水解干酪素8 g/L，蔗糖5 g/L，酵母提取物4 g/L，K2HPO4 3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L）；E. coli培养液为LB培养基，液体与固体的LB培养基在使用前加入终浓度100 μg/mL的Amp抗生素。本研究所用的所有质粒见表 1。
TaqTM DNA聚合酶、T4 DNA连接酶和各种限制性内切酶（TaKaRa公司），胶回收试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、核酸和蛋白Marker（TIANGEN）、isopropylthio-β-D-galactoside（IPTG）和蛋白纯化Ni SepharoseTM填料（哈尔滨海基生物公司），PCR仪（Biometra）、电泳仪。
1.2 方法 1.2.1 基因克隆引入点突变首先选定Clpxoo蛋白序列中第70位天冬氨酸位点D70、第99位谷氨酸E99和第166位精氨酸R166。通过两轮PCR扩增，在clp基因上相应的编码氨基酸序列位点上引入点突变D70A、E99S、R166。在突变位点处合成一对互补的引物（D70A-F和D70A-R、E99S-F和E99S-R、R166A-F和R166A-R）（表 2），分别和外侧引物（F和R）（表 2）组合进行第一次扩增，PCR扩增条件为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，35个循环；72℃ 10 min。回收相应的PCR产物后，等摩尔数混合后作为模板，再以外侧引物（F和R）进行第二次PCR，扩增条件为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，35个循环；72℃ 10 min[14, 15]。最后，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶检测、回收纯化。回收纯化产物与pEASY-Blunt载体在25℃下连接反应5 min后，通过热激法将连接产物转化至E. coli DH5α感受态细胞。提取质粒进行酶切验证，获得的阳性质粒pEASY-Blunt-clpxooD70A、pEASY-Blunt-clpxooE99S、pEASY-Blunt-clpxooR166A进行测序确证（北京华大基因生物公司）。分别测序确认编码第70位氨基酸（天冬氨酸）密码子GAU被GCU（丙氨酸）代替；第99位氨基酸（谷氨酸）密码子GAG被UCG（丝氨酸）代替；第166位氨基酸（精氨酸）密码子CGC被GCC（丙氨酸）代替。
按照文献[16-18]的方法，进行重组表达载体的构建和转化。用BamH I和Sal I分别对pEASY-Blunt-clpxooD70A、pEASY-Blunt-clpxooE99S、pEASY-Blunt-clpxooR166A和蛋白表达载体pCold-SUMO进行双酶切，利用T4连接酶在16℃条件下过夜连接，通过热激法将连接产物转化到E. coli感受态细胞BL21中，涂布Amp抗性平板，对筛选的转化子进行质粒提取、酶切和测序验证，得到阳性克隆pCold-SUMO-clpxooD70A、pCold-SUMO-clpxooE99S、pCold-SUMO-clpxoo R166A。
1.2.3 蛋白表达、纯化和验证按照文献[16, 19]的方法，进行蛋白表达和纯化。通过调整IPTG浓度、诱导时间、咪唑洗脱液浓度，对点突变蛋白ClpxooD70A、ClpxooE99S、ClpxooR166A的诱导表达和纯化条件进行了优化。挑取E. coli BL21菌落接种至LB（100 μg/mL Amp）培养基，37℃ 200 r/min剧烈振荡培养至OD600为0.6-0.8。将培养液冷却至15℃，静置30 min，加入终浓度0.5 mmol/L或1 mmol/L IPTG，在15℃下诱导16 h或24 h。离心（4 000×g、15 min、室温）收集菌体，重悬细胞，置于冰上进行超声破碎5 min，离心（10 000×g、30 min、4℃）取上清，经SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色，检测蛋白的表达。
1.2.4 ITC试验参照文献[12, 13, 20]报道以及等温滴定量热仪操作说明，进行ITC试验操作。用超纯水和滴定缓冲液进行清洗。量热池内注满30 μmol/L Clpxoo野生型蛋白或者点突变蛋白，滴定针内为60 μL的300 μmol/L c-di-GMP溶液，设置每2 μL一滴，间隔100 s，1 000 r/min拌速率进行滴定，记录热量和变化。滴定试验需重复3次，使用软件MicroCal ORIGIN version 7.0进行数据分析。
2 结果 2.1 Clpxoo蛋白定点突变、原核表达和产物纯化 2.1.1 原核表达载体的构建、转化和诱导表达通过PCR扩增，成功引入点突变，获得点突变的目的片段。将目的片段进行测序，通过与NCBI上的序列进行比对发现基因序列在定点的位置成功发生了突变。将点突变的目的片段连接到pCold-SUMO的相应的BamHⅠ和SalⅠ酶切位点后成功获得重组表达质粒pCold-SUMO-clpxooD70A、pCold-SUMO-clpxooE99S、pCold-SUMO-clpxooR166A。经BamHⅠ和SalⅠ酶切验证，得到大小约为700 bp的片段，与预期结果一致（图 1）。将重组质粒转化至E. coli表达菌株BL21感受态细胞中，在优化的诱导表达条件（在菌液浓度OD600=0.8时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG、15℃下诱导16 h）下，得到了大小为45 kD的融合蛋白（加上N端的SUMO和His 6标签），其中点突变蛋白ClpxooD70A和ClpxooE99S以可溶形式在上清中大量表达，而ClpxooR166A则发生了严重的降解现象（图 2-A）。随后不同上样量（5、10和15 μL）的SDS-PAGE分析也可以验证ClpxooR166A降解成多个条带（图 2-B）。因此，由于ClpxooR166A的降解，便采用ClpxooD70A和ClpxooE99S做蛋白纯化以及后续的ITC试验研究。
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| 图 1 点突变clp基因原核表达载体酶切验证 M：1 kb plus DNA ladder；1：clpxooD70A；2：clpxooE99S；3：clpxooR166A |
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| 图 2 Clpxoo和点突变体蛋白诱导表达以及纯化蛋白的SDS-PAGE分析 A：IPTG诱导后未纯化的蛋白表达. M：protein marker；1-4：分别为ClpxooD70A、ClpxooR166A、ClpxooE99S、Clpxoo上清液；5：pCold-SUMO空载体对照。B：IPTG诱导的ClpxooR166A的降解情况. M：protein marker；1-3：分别为5 μL、20 μL和15 μL ClpxooR166A上清液。C：纯化后的Clpxoo和点突变蛋白的SDS-PAGE分析. M：protein marker；1：（ClpxooD70A）200 mmol/L咪唑洗脱；2：（ClpxooD70A）100 mmol/L咪唑洗脱；3：（ClpxooE99S）100 mmol/L咪唑洗脱；4：（ClpxooE99S）200 mmol/L咪唑洗脱；5：Clpxoo蛋白 |
用不同浓度的咪唑缓冲液（100 mmol/L、200 mmol/L）对镍柱蛋白进行洗脱，发现使用200 mmol/L咪唑洗脱效率高，可获得高纯度的可溶性点突变蛋白（图 2-C）。经过Bradford法测定点突变蛋白浓度约为2 mg/mL。
2.2 Clpxoo和点突变蛋白与c-di-GMP结合检测在ITC试验过程中，通过数据处理软件转化计算，得到Clpxoo蛋白与c-di-GMP发生结合比例为N=0.92±0.03，解离常数Kd=（1.64±0.17）μM（图 3-A），而点突变蛋白ClpxooD70A没有与c-di-GMP发生结合反应（图 3-B）；点突变蛋白ClpxooE99S与c-di-GMP发生结合比例为N=0.919±0.12，解离常数Kd=（23.9±18.1）μM（图 3-C）。通过比较解离常数可以得知，ClpxooE99S与c-di-GMP结合的解离常数大约是Clpxoo与c-di-GMP的15倍。所以与Clpxoo蛋白相比，ClpxooE99S与c-di-GMP的结合能力大大降低。因此，当Clpxoo蛋白的第70位天冬氨酸突变后，点突变蛋白ClpxooD70A丧失了与c-di-GMP结合的能力；当第99位谷氨酸突变后，点突变蛋白ClpxooE99S减弱了与c-di-GMP结合的能力。
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| 图 3 ITC检测蛋白与c-di-GMP的结合反应 A：c-di-GMP与野生型Clpxoo蛋白结合情况；B：c-di-GMP与ClpxooD70A结合情况；C：c-di-GMP与ClpxooE99S结合情况 |
目前被研究清楚的是存在于绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）中的一类转录调控蛋白FleQ，而且研究表明FleQ也是小分子第二信使c-di-GMP的受体蛋白[21, 22]。有研究表明，属于CRP/FNR家族蛋白的转录调控因子通常会受到小分子效应因子如cAMP、c-di-GMP、O2等的影响[23, 24]。其中，小分子第二信使c-di-GMP可以与受体蛋白Clpxoo结合来影响转录调控因子Clpxoo对下游基因表达的调控，最终影响Xoo细菌的生理进程[2]。然而，作为c-di-GMP信号受体蛋白的Clpxoo转录调控靶基因的机制并不清楚。因此，本研究通过确定转录调控因子Clpxoo与c-di-GMP结合的关键功能位点，来揭示调控蛋白Clpxoo与小分子c-di-GMP的结合特征，并为进一步阐明c-di-GMP介导下的Clpxoo调控基因的机制奠定基础。
本研究通过对Clpxoo蛋白的关键氨基酸位点进行定点突变，原核表达载体构建和转化、蛋白诱导表达纯化和验证，在优化的诱导表达条件下，成功获得了大量的Clpxoo点突变蛋白，为后续ITC试验确定水稻白叶枯病菌c-di-GMP受体Clpxoo关键功能位点的确定做准备。为了验证Clpxoo蛋白第70位天冬氨酸、第166位精氨酸和第99位谷氨酸突变后是否会对蛋白的表达纯化有影响，本研究首先优化了点突变蛋白的表达纯化条件。设置了0.5 mmol/L、1 mmol/L终浓度的IPTG，以及100 mmol/L、200 mmol/L的咪唑洗脱浓度，发现点突变蛋白在经0.5 mmol/L终浓度IPTG的诱导下表达量最高，经200 mmol/L浓度的咪唑洗脱效率最高。此外，对ITC试验中蛋白与小分子c-di-GMP的比例进行了摸索，最终确定了最佳的点突变蛋白和c-di-GMP的摩尔比为1:10，即点突变蛋白为30 μmol/L，小分子c-di-GMP为300 μmol/L。将Clpxoo蛋白第166位的精氨酸突变成丙氨酸后，点突变蛋白会发生严重的降解现象，而且随着蛋白放置时间变长降解现象加剧。氨基酸位点的突变后会使蛋白发生降解，说明此位点对于蛋白的稳定性至关重要。而在前期对Clpxcc与c-di-GMP关键结合位点的研究中并没有对点突变蛋白降解的报道。因此，Clpxoo蛋白第166位精氨酸突变成丙氨酸后发生降解的机制有待于进一步试验研究。
通过ITC试验分析，发现与Clpxoo蛋白相比，将第70位天冬氨酸突变后，ClpxooD70A蛋白无法与c-di-GMP结合；第99位谷氨酸突变成丝氨酸后，ClpxooE99S蛋白与c-di-GMP的结合能力大大减弱。表明在Clpxoo蛋白的许多氨基酸中，第70位天冬氨酸和第99位谷氨酸都是Clpxoo的关键功能位点。本研究获得的不结合c-di-GMP的点突变体D70A和结合能力降低的点突变体E99S，为今后利用EMSA技术研究c-di-GMP对Clpxoo与目的基因启动子结合的影响奠定了基础。
4 结论Xoo的转录调控因子Clpxoo蛋白中第70位天冬氨酸D和第99位谷氨酸E是Clpxoo与c-di-GMP结合的关键功能位点。
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