细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）是高等植物中不能产生有功能花粉的一种母性遗传性状^[1]。研究认为，一般情况下CMS背景下的花粉败育是与线粒体基因组非正常的重组产生的嵌合ORFs相关的^[2]。很多与CMS相关的线粒体基因能被一个或多个核恢复基因的产物抑制或削弱^[3]。因此，CMS不仅是杂种优势利用的基础，在农业生产上具有重要价值，而且研究CMS性状为研究线粒体基因和核基因之间的相互作用提供了一条有效的途径。

CMS作为高等植物的一种重要的生物学性状，要了解其发生机制，必须对其CMS发生的分子机理进行深入的研究。目前为止，在各种植物中已经确定了超过50种线粒体CMS相关基因^[4-7]。然而线粒体可读框导致雄性不育的特异作用机理目前尚不清楚，需要更好的证据来证明线粒体orf针对性表达导致雄性不育。

雄性不育的形成涉及育性相关基因在一定时空上的表达及其参与的复杂生理生化过程。以往对花粉发育突变体的研究大多着重于突变基因本身的表达特点、作用方式和在花粉发育中的功能，很少注意此基因突变所引起的其它基因的表达变化，但如果没有从线粒体到细胞核的信号转导，线粒体蛋白单独直接导致雄性不育是不可能的。由于在基因表达中存在线粒体和细胞核之间的相互作用^{[8, 9]}，从线粒体到细胞核的信号被称为线粒体反向调控（mitochondrial retrograde regulation，MRR）。研究表明，植物基因突变造成的线粒体功能障碍，通过改变核基因的表达导致雄性不育的发生^[10]。近年来，许多研究都集中在线粒体对高等植物核基因表达的调控作用上^[11-14]。将遗传学和转录组分析结合起来研究突变体，已成为一种解析真核生物细胞功能分子网络中的转录组分的有效方法^[15]。

转录组的研究方法主要有：（1）基于杂交技术，如CDNA芯片和寡聚核苷酸芯片；（2）基于测序技术，如早先基于Sanger测序的SAGE（serial analysis of gene expression）和大规模平行测序（massively parallel signature sequencing，MpSS）技术、全长cDNA文库和EST文库测序；现在对cDNA、EST等的测序工作已升级为第二代测序技术，即（3）转录组测序技术（transcriptome sequencing）。新一代测序（next generation sequencing，NGS）技术的出现如Illumina Solexa、罗氏454以及ABI的固体平台通过提供廉价和快速的基因组和转录组数据已经彻底改变了生物学的研究模式^{[16, 17]}，提供了一个从众多的分子标记或差异表达基因中来确定与某一特征相关关键基因的机会，可以用来预测单个基因的相互作用，以及阐明更复杂的信号通路。

拟南芥的遗传分析和转录组研究为研究花粉发育和功能开了先河^{[18, 19]}。10多年来，雄性不育的研究主要集中在差异表达基因（differentially expressed genes）的研究上^[20]。采用DNA芯片和RNA测序技术进行转录组分析能够在同一个实验中分析和比较成千上万个基因，这为在基因组水平上更好地了解植物生长和发育机制以及遗传变异提供了可能^[21]。

1 采用微阵列进行CMS转录组研究

到目前为止，仅在水稻、油菜、大白菜和棉花中尝试采用微阵列鉴定与CMS相关基因的转录组分析。有限的关于CMS微阵列研究表明了细胞核和线粒体相互作用在核基因调控细胞器基因表达中的重要性，同时细胞器如线粒体信号传递也调控核基因的表达，即反向信号^[22]。

Carlsson等^[11]采用拟南芥花器官特异cDNA微阵列检测到了大量的存在于芸薹属植物（Brassica napus）的CMS系和其正常可育的保持系中的花组织差异表达的核基因。核基因编码的蛋白质导入细胞器、雄蕊，并影响花粉特异表达基因。与保持系相比，CMS系中参与细胞壁重构的基因表达被抑制。研究结果表明，细胞质雄性不育是线粒体通过调节细胞核基因的表达及调控花的发育所致。

Fujii等^[22]进行了CW-CMS系和具有正常水稻（Oryza sativa）细胞质的保持系rf17rf17成熟花药中的比较核基因表达研究。在CMS系多于3个发育阶段中，观察到上调表达的8个基因和下调表达的82个基因。CMS系中一些极端上调表达基因包括编码交替氧化酶（AOX）、蛋白酶家族、myb家族转录因子和mRNA结合蛋白。下调基因包括过氧化物酶、果胶酶家族蛋白、叶绿素b结合蛋白、钙结合蛋白和MATE外流性运转家族蛋白。植物CMS的发生是由于线粒体基因功能的丧失，这些结果显示线粒体反向调控在核基因特异表达中起重要作用，而且这种调控作用导致的核基因表达改变对CMS植株有特殊的效应。在CW-CMS水稻中下调表达的基因DCW11--编码线粒体蛋白磷酸酶2c，被证明是与CMS相关的^[23]。

Dong等^[24]采用芜菁300-K低聚探针（br300 k）芯片对Ogura-CMS白菜及其保持系进行花蕾转录组分析，以研究芜菁亚种-大白菜细胞质雄性不育（CMS）的调节机制。通过微阵列鉴定了4 646个在中国大白菜Ogura-CMS系和其保持系B. rapa ssp.的花蕾间差异表达基因。Ogura-CMS系有与胁迫和氧化还原相关的特异表达基因，但是缺乏与花粉外壁和萌发相关的表达基因。许多与生长素相应、ATP合成、花粉发育和逆境应激反应相关的核基因在Ogura-CMS植株中延迟表达，延迟表达可能减少花粉的产生和/或导致不育，这意味着线粒体反向信号抑制核基因表达。

在棉花CMS的转录组研究中，Suzuki等^[25]采用包括24 132个转录本的棉花基因组微阵列，研究具有D8细胞质的棉花CMS及其恢复系处于减数分裂时期的花蕾之间的差异表达基因（DE）。在CMS-D8中共检测到458个DE基因，其中包括上调127个基因和331个下调基因。最常见的基因是参与细胞壁扩张的编码假定蛋白，如果胶、果胶酸裂解酶、果胶甲酯酶、乙二醛氧化酶、多聚半乳糖醛酸酶、吲哚乙酸合成酶和木葡糖内切酶。细胞骨架范畴的基因包括肌动蛋白在不育系和可育系之间高度差异表达，肌动蛋白在细胞壁扩张、细胞延伸和细胞分裂中期重要作用。研究结果认为，细胞核基因编码的恢复基因不仅恢复功能性花粉的形成，而且也影响着众多核基因编码的基因；通过下一步的研究，从大量的差异表达基因中将筛选出与CMS形成相关的基因。

2 采用RNA测序进行CMS转录组研究

尽管基于微阵列的转录谱研究可以详细检测不同样品中的基因表达，但这种方法具有局限性，因为基因通过非特异性探针设置表明，不能可靠检测到低水平的表达。高通量的转录组测序分析是转录组分析的一个强有力工具。

近年来，RNA测序已经广泛应用于多种植物的转录组研究^[26-32]，并已应用到辣椒、油菜、棉花、柑橘和红麻等植物的CMS不育机理的相关研究中。

Liu等^[33]对辣椒细胞质雄性不育系121A及其近等基因系121C的转录组进行了分析，并分析了基因（unigene）表达的不同丰度。总共5.3 GB的数据组装成85 144个基因，分别从121A和121C组装了71 576和75 920个基因，发现4 326和7 061个基因分别在121A和121C中高丰度表达。研究认为许多差异表达基因是育花粉形成或花粉败育的候选基因，为研究线粒体与细胞核相互作用对育性的影响和恢复以及进一步研究提供了线索。

Yan等^[34]利用Illumina/Solexa测序平台，对油菜不育株和可育株小花蕾进行全基因组高通量转录组测序。从两个文库中分别得到242 163（不育）和253 507（可育）个差异标签。分别以白菜和甘蓝CATG + 17核苷酸序列的基因组与转录组为参考序列，对所有的差异序列标签进行注释。在显著差异表达水平上检测到3 231个的白菜基因和3 371个甘蓝基因差异表达。研究结果认为：一些基因在不育系和可育系间差异表达，其中的一些基因可能成为今后研究CMS、育性恢复和农艺性状改良的候选基因。

雄性不育和无核性状是柑橘品种改良理想性状。Zheng等^[35]通过原生质体融合培育了一个胞质杂种柚，是一个雄性正常可育柚的变种。为了了解其发生的分子机制，采用RNA序列分析，比较了胞质杂种和正常可育柚花蕾中核基因表达谱。通过基因表达谱捕获了大量的在花瓣原基和雄蕊原基区分的阶段两系间差异表达基因（DEGs）。CMS相关基因的鉴定为研究细胞核和线粒体之间的相互作用提供了新的认知。

Chen等^[36]采用Solexa测序技术，对红麻细胞质雄性不育系及其保持系进行了比较转录组分析，获得4 584个在两系间至少2倍差异表达的基因。其中在不育系中有838个基因的表达量至少高出5倍于其保持系中的表达量，528个基因则在不育系中显著下调表达。研究认为，该研究为了解红麻花药发育及CMS产生机理奠定了基础。

An等^[37]为了研究pol-CMS的雄性不育转换机制，构建了pol-CMS的近等基因系。采用RNA测序技术比较了不育和可育花蕾的基因组表达谱，结果表明有1 148个基因在不育系与可育系花蕾中显著差异表达，这些差异表达基因主要分布在代谢和蛋白质合成途径中。此外，控制花药发育的一些基因在不育花蕾显著下调。研究结果认为，由orf224/atp6引起的能量缺乏导致一系列调控花粉发育的基因被抑制，这种抑制作用是通过线粒体和核基因之间的相互作用实现的。从而导致造孢细胞分化的失败和pol-CMS的产生。

王娇^[38]以棉花细胞质雄性不育系中棉所12A（细胞质来自104-7A）和保持系中棉所12为研究材料，采用Illumina新一代高通量测序技术对花药转录组表达谱进行比较分析，并采用代谢物衍生化程序结合气相色谱质谱联用（GC-MS）和液相色谱质谱联用（LC-MS）两种分析技术对不育系和保持系花药差异积累的代谢物进行分离和鉴定。通过对转录组和代谢组数据进行综合分析，推测苯丙素、黄酮类物质合成受阻、代谢加快导致体内这类物质积累减少，这可能是导致104-7A棉花细胞质雄性不育形成的原因之一。

我们的研究^[39]以棉花晋A细胞质雄性不育系及其同核异质保持系JB为研究材料，分析了两个材料在造孢细胞（sporogenous cells stage，SS）和小孢子母细胞（microsporocyte stage，MS）时期花蕾的差异表达基因。结果显示：在花药发育的两个阶段，分别有5 457（SS）、3 178（MS）和3 608（SS）、3 999（MS）个基因分别在JA和JB中差异表达。对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析，发现JA不育系与保持系相比，在JA花药发育的造孢细胞时期和小孢子母细胞时期的花蕾中氧化还原酶和双加氧酶活性下降，而与光合作用相关基因则更多地表现为上调表达，并且发现JA细胞质雄性不育与能量代谢异常相关。这些差异表达基因为鉴定棉花晋A细胞质雄性不育相关基因提供了保障。通过对RNA-seq转录组测序资料的进一步分析，将获得细胞质反向调控细胞核基因的表达模式，为阐明雄性不育的分子机制奠定基础。

3 线粒体对细胞核基因的反向调控研究

线粒体和质体的反向信号影响细胞核基因的表达，从而产生与发育和生理状态相关的协调的细胞器组分。尽管线粒体的反向调控在酵母中已经得到比较清楚的研究，但对植物中的MRR的过程及机制仍不清楚^[40]。由线粒体基因突变导致的细胞质雄性不育是线粒体反向调控典型例子，也是研究MRR的良好材料。

玉米CMS-T不育性是由于mtDNA重排造成的，mtDNA重排产生了T-urf13，并编码一种特异的蛋白质URF13，而URF13是T毒素的受体^[41]。后来的研究表明T毒素和URF13之间相互作用，导致线粒体内膜的通透性增加和细胞死亡。用一种模仿的T毒素处理CMS-T不育系，诱导了核基因编码的热激蛋白和醇脱氢酶基因的表达。线粒体ATP合酶的亚基9的烟草突变体，表现为雄性不育^[42]，其表现为形态改变和呼吸降低。在此突变体中由核基因编码的几个复合体Ⅰ亚基上调表达。这可能是由于线粒体功能紊乱引起的MRR。CMSⅡ是烟草的一种线粒体突变体，该突变体缺乏功能性复合物Ⅰ^[43]。在该突变体中核基因的表达发生改变，导致细胞内交替氧化酶、抗坏血酸氧化酶和超氧歧化酶基因上调表达，NAD（P）H脱氢酶活性升高，突变导致细胞氧化还原状态的调整^{[43, 44]}。这种突变体严重抑制了表型生长，并改变了碳和氮的代谢^{[43, 45]}。基于线粒体电子传递链功能的改变，CMSⅡ突变体植株获得了一个全新的内稳态，这种内稳态可能是线粒体向细胞核信号传递的改变造成的。

参与花/小孢子形成、细胞程序性死亡（progr-ammed cell death，PCD）、能量代谢、信号转导和蛋白质运输被认为是MRR潜在的目标^{[11, 22, 45]}。Xu等^[46]的研究认为，TaFAd基因可能是小麦T-CMS系MRR的目标，只是其究竟是MRR的主要目标，还是级联信号的一个下游组分还不清楚。研究认为，mtROS可能作为触发信号传导分子^{[47, 48]}。同哺乳动物细胞一样，来源于线粒体的Ca2+^[49]、线粒体的氧化还原状态和代谢产物的变化可能也是MRR的信号^[50]，反向调控作用主要通过转录水平调控实现^[51]。目前，虽然阐明了线粒体功能紊乱对核基因表达的影响^[52]，但是对植物的基本调节机制的认识仍然有限。

通过对CMS及其正常可育系进行转录组学研究，将获得一系列在两系间差异表达的基因，从而可以深入了解细胞质雄性不育基因的反向调控作用，揭示植物细胞质雄性不育形成的分子机制。

4 转录组分析应用展望

转录组测序主要通过高通量测序研究特定组织或细胞在某个时期转录出来的mRNA。与基因芯片技术相比，高通量RNA测序即RNA-seq无需设计探针，能在全基因组范围内以单碱基分辨率检测和量化转录片段，并能应用于基因组图谱尚未完成的物种^[53]。同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并准确地识别可变剪切位点及cSNP、UTR区域；不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。

转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，包括基因表达、基因调控和蛋白质氨基酸含量的信息^[54]。因此，转录组分析是解读基因组的功能要素、揭示细胞和组织的分子成分的重要手段。在细胞质雄性不育机理的研究上，通过转录组分析将获得详细的相关分子分析，了解线粒体与核基因之间的相互调控作用方式，并有助于雄性败育机理的解析。

由于花粉的发育是由正义和反义转录本的表达以及小分子RNA调节的一个复杂的过程^[55]。基因的转录丰度与基因表达产物的活性没有必然的联系，仅用基因表达量的变化来反映花粉发育的生理及分子机制显然不够准确。蛋白质组学和代谢组学技术作为对基因活性认识的下游技术，为更加准确地理解分析花粉发育过程提供了研究手段。再则，认识不育基因调控花粉败育过程，需对花药细胞结构和功能以及花粉细胞中重要的细胞生物学形态进行分析。因此，在组学分析的基础上进行分子和遗传研究，以期更好地解析植物雄性不育的机理。