谷胱甘肽（glutathione，GSH）是胞内含量最丰富的硫醇类化合物，普遍存在于哺乳动物、植物、酵母及原核生物中，是由L-谷氨酸（L-Glu）、L-半胱氨酸（L-Cys）、甘氨酸（Gly）组成的三肽[1]。GSH的生物学意义主要归功于其半胱氨酸残基上的巯基，因而具有独特的氧化还原能力和亲和属性[2]。生物体蛋白质及DNA的合成以及细胞周期调控均离不开GSH的参与。同时，GSH还与细胞耐热性、外分泌、生长维持、调节氧化还原平衡、解毒及半胱氨酸的储存和运输有关[3-6]。这种三肽还能调节基因表达、细胞凋亡、信号转导及内外源分子的膜运输，对维持胞内稳态具有重要作用[7]。
GSH已经广泛应用于制药、食品及化妆品行业，市场上对GSH的需求与日俱增。微生物发酵法生产GSH因其低成本、小污染、高密度、条件温和等特点而备受青睐，但胞内高浓度的GSH积累造成的对关键合成酶的竞争抑制以及胞内毒性是GSH高产及产业化的两大瓶颈[8, 9]。双功能酶基因gshF的发现解决了产物的抑制问题，GshF同时具有谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）及谷胱甘肽合成酶（GS）活性，对GSH不敏感，在生产上具有极大潜力，在生产宿主中过表达gshF后，GSH的生产得到促进，且检测不到发酵中间物γ-谷氨酰半胱氨酸的存在[10]。当GSH合成酶的活力问题得到解决，高浓度GSH的胞内毒性问题就显得非常突出。
利用微生物发酵法生产时，GSH的合成主要发生在胞内，而GSH在胞内主要以还原型多肽形式存在，产物积累过多会扰乱氧化还原平衡，对菌体生长及代谢带来严重影响，引起代谢控制阻遏产物积累，甚至导致细胞自溶[8]。因此将GSH由胞内转运到胞外不仅是降低其胞内积累的有效手段，而且也是提高产量的重要方法之一。同时，在GSH的下游提取过程中，因其为胞内产物，要获得纯品就需先将其从细胞中提取出来，主要采用提取工艺中破碎法，但因释放出GSH时会附带出杂质成分如蛋白质、核酸、氨基酸等细胞组分以及细胞碎片，使得分离过程耗时耗力、成本增加，如果GSH被细胞主动转运到胞外，能节省不必要的工序、简化工艺[11]。此外，GSH在胞内的平衡浓度及其生理功能也与其运输有关[12]，因此对GSH运输蛋白的研究至关重要。
关于原核生物的GSH运输蛋白，国外研究多有报道。Pittman等[13]确定了原核生物第一个GSH运输系统即CydDC复合物，该复合物为膜运输蛋白，运输过程需要ATP参与。CydDC作为大肠杆菌异质二聚体ABC（ATP-binding cassette-type transporter）型运输系统，最初发现于E. coli细胞色素bd型末端氧化酶的装配过程中；1993年发现其为ABC运输蛋白[14]；2002年，证明cysteine经CydDC进入翻转膜泡，最后被运出细胞质达到壁膜间隙[15]；2005年证明该运输蛋白能运输GSH到周质中。CydDC对还原型GSH有高亲和力，但对氧化型及GSH结合物亲和力低，故运输GSH而不运输GSSG。专利中也实现了CydDC的表达[16]。
为降低胞内产物积累、减少生产阻遏及胞内毒性进而提高产量，本文重点研究目的蛋白CydDC的表达对产GSH重组大肠杆菌胞外GSH浓度的影响，以期促进GSH的生产。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株及质粒本研究所使用的菌株及质粒如表 1所示。
GSH标准品购自Sigma公司；氯霉素、氨苄青霉素购自上海捷倍思基因技术有限公司；质粒小提试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；Taq DNA Polymerase、2×Taq PCR MasterMix、Hind Ⅲ、PrimeSTAR HS（Premix）购自天根生化科技有限公司。
1.1.2.2 培养基Luria-Bertani液体培养基：Tryptone 10 g/L，Yeast Extract 5 g/L，NaCl 10 g/L，121℃灭菌20 min。Luria-Bertani固体培养基：上述液体培养基中加入1.6 g/L琼脂粉，121℃灭菌20 min。摇瓶培养基：含5 g/L glucose的50 mL Luria-Bertani液体培养基，葡萄糖与Luria-Bertani分开灭菌，葡萄糖115℃灭菌20 min。培养基中添加合适的抗生素：氯霉素34 mg/L，氨苄青霉素50 mg/L。
1.2 方法 1.2.1 实验方法 1.2.1.1 重组质粒构建重组质粒pBAD33-cydDC构建过程，如图 1，根据载体pBAD33设计引物，使PCR扩增出的目的片段cydDC两端带有载体的同源臂，cydDC上游引物序列含20 bp载体同源臂，序列为：5'-ACCTGCAGGCATGCAAGCTTGAGGAGGACAG-CTATGAATAAATCTCGTCAAAA-3'（下划线部分为Hind Ⅲ酶切位点，斜体部分为核糖体结合位点）；下游引物序列包含载体酶切位点Hind Ⅲ右侧20 bp同源臂，序列为：5'-CCGCCAAAACAGCCAAGCTTTTACAAACCCTGCTTGAACT-3'。PCR获得目的片段后，利用ClonEXpressTMⅡ试剂盒将cydDC片段与经Hind Ⅲ酶切后线性化的质粒pBAD33进行同源重组，37℃反应30 min进行连接，再将连接后得到的重组质粒转化MG1655感受态细胞，经氯霉素筛选出抗性重组菌。取质粒pBAD33多克隆位点两侧各20 bp序列作为验证引物，其中上游引物序列为：5'-GCTCTTCTCGCTAACCAAAC-3'，下游引物序列为：5'-GTTCACCGACAAACAACAGAT-3'，对重组菌进行PCR验证，并且抽提质粒送上海生工进行测序验证。
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| 图 1 质粒pBAD33-cydDC构建图 |
利用氯化钙转化法将重组质粒pTrc99a-as转入大肠杆菌MG1655（pBAD33-cydDC），过夜培养，经含有氨苄青霉素及氯霉素的平板筛选，挑取单菌落，保种并进行PCR验证，待PCR验证后进行蛋白电泳。
1.2.1.3 培养重组菌于装有3 mL Luria-Bertani液体培养基试管中复苏，放于37℃、220 r/min摇床培养9 h，转接摇瓶培养基，菌浓OD600=0.5时加入0.5 mmol/L IPTG及50 mmol/L阿拉伯糖诱导，并按时取样，时间点为2.5、5和8.5 h，检测发酵液及上清液中GSH的产量并计算其胞外含量。
1.2.2 分析方法 1.2.2.1 菌体密度测定菌体培养过程中，用可见光分光光度计在600 nm检测菌液的吸光值。
1.2.2.2 GSH的测定样品经三氯乙酸TCA处理20 min后，4℃、12 000 r/min离心10 min，上清液稀释10倍后经0.22 μm膜过滤处理方可进样。液相条件：C18柱（4.6×150 mmol/L），流动相A为含0.01 mol/L庚烷磺酸钠和0.05 mol/L磷酸二氢钾的溶液（磷酸调pH3.0），流动相B为甲醇；液相检测时流动相为95%的A和5%的B的混合液，流速1.0 mL/min，紫外检测器波长为210 nm，柱温30℃。
1.2.2.3 电泳分析核酸电泳缓冲液及蛋白电泳缓冲液、染色、脱色液的配制参见《分子克隆》。
2 结果 2.1 重组菌MG1655（pBAD33-cydDC）的构建根据图 1构建的重组质粒pBAD33-cydDC的PCR验证结果，见图 2。以空质粒pBAD33为模板，验证引物进行PCR扩增，只能得到长度不足100 bp的产物，而以重组质粒为模板时，PCR产物长度为3 500 bp，测序结果正确，表明重组质粒构建成功并顺利获得重组菌MG1655（pBAD33-cydDC）。
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| 图 2 重组质粒pBAD33-cydDC的PCR验证 M：λ-Eco T14 digest DNA marker；1：MG1655（pBAD33）；2，3：MG1655（pBAD33-cydDC） |
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| 图 3 重组菌cydDC基因的表达 M：小分子量蛋白Marker；1：MG1655（pBAD33）；2-4：MG1655（pBAD33-cydDC） |
重组菌株MG1655（pBAD33-cydDC）经阿拉伯糖诱导后，进行SDS-PAGE电泳，电泳结果如图 3所示。文献报道中的CydDC两亚基理论大小为61、59 kD[4]，图中实验组可见两条清晰区带，与对照组相比，蛋白条带亮度增加，且大小与理论值相吻合，表明目的蛋白成功表达。
2.3 重组菌MG1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）的蛋白表达含双质粒的重组菌经IPTG和阿拉伯糖诱导后，进行SDS-PAGE电泳。结果（图 4）显示，与对照组相比，实验组有3条清晰区带，分别位于85、61和59 kD处，与理论位置相符，目的蛋白GshF及CydDC均表达成功。
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| 图 4 重组菌目的基因的表达 M：小分子量蛋白Marker；1：MG1655（pTrc99a）；2-7：MG1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC） |
分别对MG1655（pTrc99a-as/pBAD33）和MG-1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）进行培养，并检测培养细胞的谷胱甘肽合成。结果（图 5）显示，诱导后，随着培养时间延长，GSH产量逐渐增加，5 h达到最高，8.5 h因产物降解及氧化，产物积累有所降低。运输蛋白CydDC的过表达促进了产物谷胱甘肽的生产，5 h时重组菌MG1655（pTrc99a-as/ pBAD33-cydDC）的GSH产量是MG1655（pTrc99a-as/pBAD33）的1.11倍。
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| 图 5 GSH生产对比 |
胞外GSH含量对比结果（图 6）显示，摇瓶培养时，对照菌MG1655（pTrc99a-as/pBAD33）胞外GSH含量达63.4%；过表达cydDC基因能促进GSH的胞外运输，MG1655（pTrc99a-as/pBAD33-cydDC）胞外GSH占总GSH的81.9%，是对照的1.29倍。
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| 图 6 发酵样品上清液中GSH含量对比 |
底物的有效输出一直是高密度发酵法生产GSH所需解决的重要问题之一，国内外就如何提高胞外GSH含量做了许多研究。李华钟等[17]构建一株具有高谷胱甘肽合成活性的重组大肠肝菌，在发酵过程中对菌体进行通透性处理使得产物GSH分泌到细胞外，产量得到提高，但处理过程使用到甲苯等有毒的有机溶剂，不利于工业化。Perrone等[18]构建一株重组酵母菌，过表达gshⅠ和gshⅡ，并失活hac1及hgt1等相关基因，使酵母菌发酵过程中GSH分泌到胞外，但专利报道总GSH产量仅为0.06 mmol/L，胞外为0.03 mmol/L。Nie等[19]在利用产阮假丝酵母高密度发酵生产的基础上，考察了低pH胁迫对GSH合成的影响，结果表明，在发酵24 h后将pH由5.5降至1.2并维持6 h，细胞内的GSH几乎全部释放到胞外，GSH终产量是未处理前的1.25倍。
无论是添加表面活性剂对发酵菌体进行通透性处理，还是改变发酵条件进行胁迫，对GSH的分泌都起到一定作用，但同时也增加了发酵过程的操作难度及下游分离操作的难度，可见对菌体本身改造的重要性。
除了原核生物的GSH运输蛋白，真核生物的运输系统国外也有报道。Ballatori等[20]阐述了还原性谷胱甘肽的运输机制，介绍了膜蛋白家族MRP/CFTR/ABCC和OATP/SLC21A在谷胱甘肽运输中的作用。Kaluzna等[21]研究了大肠杆菌中谷胱甘肽S结合体的运输，证明了其与真核细胞运输的过程一致。Bourbouloux等[22]阐明了酵母高亲密性谷胱甘肽输入蛋白Hgt1p（OPT系统成员），该系统与其他酵母和一些植物中运输GSH的系统相似，但与大肠杆菌及大多高等真核生物中的不同。许善峰[23]专利中报道了一株重组毕赤酵母，能分泌生产GSH，其特征在于过表达基因MRP2突变体，并失活胞外向胞内运输谷胱甘肽的基因Hgt1，产物的运输得到明显改善，GSH产量也得到显著提高。CydDC作为原核生物的膜结合型运输蛋白，目前尚无在大肠杆菌中过表达以改善GSH运输的报道。本研究实现了GSH运输蛋白的表达，验证了其运输作用，对今后进一步提高GSH发酵生产具有重要意义。
4 结论本研究在大肠杆菌中过表达ABC型蛋白CydDC，并验证了其对谷胱甘肽的运输作用。过表达cydDC基因的重组菌，谷胱甘肽产量得到提高，达到0.22 mmol/L，且胞外GSH含量明显增加，达到81.9%，分别是对照的1.11倍和1.29倍。
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