红麻（Hibiscus cannabinus L.）属于锦葵科木槿属一年生韧皮纤维作物，传统用途是作为纺织、生产麻绳、麻袋、地毯等的原料。同时，红麻也是一种多用途作物，被广泛应用于造纸、建材、土壤修复、饲料等各种领域^[1-2]。

作物细胞质雄性不育（CMS）是作物杂种优势利用的主要途径，利用CMS配制杂交种，克服了人工授粉的种种弊端，大大减少劳动量，同时能够提高杂交种子的纯度，增加作物的产量^[3]。作物雄性不育表现为花药（包括花粉）的发育异常。花药的发育是一个受到严格调控的过程，特别是在转录水平的调控尤其重要。转录因子是这一调控过程中的主要参与者，在众多的转录因子中，MYB类转录因子是植物中最大的一类转录因子家族之一。目前众多研究结果表明MYB类转录因子的功能具有多样性，包括参与植物次生代谢调控，激素和环境因子的应答，细胞分化及细胞周期等多种过程^[4]。MYB21属于R2R3型MYB类转录因子，Song等^[5]在拟南芥中发现AtMYB21基因与AtMYB24能够与JAZ蛋白相互作用而影响茉莉酮酸酯（JA）的代谢，从而调控雄蕊花药的发育。姚润鹏^[6]从大白菜花瓣退化突变体的转录组分析中发现了MYB21基因是与花器官发育相关的。Cheng等^[7]在研究赤霉素（GA）和茉莉酸（JA）对拟南芥的作用时发现GA能够促进JA的生物合成而调控MYB21基因的表达，从而促进雄蕊花丝的延伸。但是迄今为止还没有看到有关MYB类转录因子调控作物CMS发生的研究报道。本课题组前期通过转录组测序发现红麻MYB21的表达量在CMS系花药中显著下调，故推测MYB21参与了红麻CMS发生的调控。基于此，本研究克隆MYB21基因，研究MYB21在红麻不育系和保持系不同的组织器官的表达模式，并构建MYB21基因的过表达与干扰载体，旨在为研究MYB21基因在红麻花药发育中的功能奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

红麻不育系P3A与保持系P3B（本课题组选育）种植于广西大学实验基地。

主要试剂及菌株：CTAB裂解液、DEPC，DNAaseI，反转录试剂盒，Fastpfu酶，DNA回收试剂盒，T4 DNA连接酶，大肠杆菌感受态细胞DH5α，LB培养基，各种相关限制性内切酶，相关载体，荧光定量试剂盒等。

1.2 方法 1.2.1 红麻花药总DNA和总RNA的提取

红麻不育系P3A和保持系P3B，取盛花期时的花药，置于-80℃冰箱保存，采用改良CTAB法^{[8, 9]}提取总DNA和总RNA，利用琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度测定仪来检测DNA和RNA的完整性。

1.2.2 反转录

用PrimeScript Reverse Transcriptase反转录试剂盒（TaKaRa，日本）进行反转录，并以红麻跨内含子引物COXⅡ检测反转录得到的cDNA中是否含有总DNA。

1.2.3 MYB21基因全长的克隆

根据不育系（P3A）和保持系（P3B）花药转录组高通量测序结果^[10]设计引物（表 1）扩增红麻MYB21基因全长。PCR扩增选用高保真酶Fastpfu DNA聚合酶，扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃ 30 s，53℃ 40 s，72℃ 1 min，32 个循环；72℃延伸10 min。同时以ddH₂O为模板设置阴性对照。PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒回收并连接到pMD-19T载体上，转化到大肠杆菌感受态DH5α中，挑取阳性克隆送至华大基因测序。

1.2.4 红麻MYB21基因过表达载体的构建

根据已经克隆的MYB21基因开放阅读框序列设计加入相应酶切位点的一对引物ORF-R和ORF-F（表 1），以红麻花药反转录得到的cDNA为模板，采用高保真酶FastPfu DNA 聚合酶进行PCR扩增，凝胶回收PCR产物，然后连接、转化，挑取阳性克隆测序，用限制性内切酶Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切阳性质粒并凝胶回收小片段，同时双酶切PBI121-GFP载体并回收，最后连接、转化，以卡那霉素筛选阳性菌落，菌液测序并提取质粒进行酶切验证。

1.2.5 MYB21基因RNAi干扰载体的构建

根据干扰载体序列选取的原则^[11]，选择MYB21基因的cDNA的428 bp序列作为干扰片段，并根据中间载体PKNANIBAL上的插入位点，设计正向引物与反向引物（表 1）进行克隆。克隆得到的正向片段命名为RNAi-Z，反向片段命名为RNAi-F。

正向片段的插入：用Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切RNAi-Z质粒和PKNANIBAL质粒，经回收，连接、转化，以卡那霉素平板筛选阳性克隆，酶切鉴定连接正确后命名为PK-R1。

反向片段的插入：用Xba Ⅰ和Cla Ⅰ双酶切PK-R1和RNAi-F，经凝胶回收、连接、转化、质粒抽提，质粒酶切确认连接正确后命名为PK-R1-F2；

最后，将PK-R1-F2连接到植物双元表达载体pART27上：采用Not Ⅰ分别酶切PK-R1-F2和pART27，回收、连接、转化之后，以含有壮观霉素的平板来筛选阳性克隆，菌液测序并质粒酶切鉴定后确认RNAi干扰载体构建成功，将此载体命名为pART27-PK-R1-F2。

1.2.6 荧光定量PCR

选择红麻甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH为内参基因，设计MYB21基因和GAPDH基因的荧光定量的引物（表 1），分别用P3A和P3B的根、叶和花药部分的总RNA反转录的cDNA为模板，TransStart Tip Green qPCR SuperMix荧光定量试剂盒（北京全式金公司）进行荧光定量PCR研究MYB21基因的表达模式。反应体系为15 µL：模板为1.5 µL，样品设3次重复，同时设置以水为模板的阴性对照。以95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，36 cycles的反应程序在荧光定量仪器（Bio-Rad，美国）上进行扩增反应。

2 结果 2.1 红麻核酸质量及反转录检测

从琼脂糖凝胶电泳图（图 1-A）可以看出，提取的红麻不育系P3A和保持系P3B花药总RNA条带清晰，完整性较好。Not Ⅰ有DNA污染，以跨内含子引物对COXⅡ-R和COXⅡ-F对反转录的cDNA进行PCR扩增。该引物对以总DNA为模板扩增出来的片段是2 009 bp，以cDNA为模板扩增出来的片段是518 bp，琼脂糖凝胶电泳图结果（图 1-C）显示，反转录得到的cDNA没有总DNA残留。cDNA质量满足实验的需要。

2.2 MYB21基因全长的克隆

分别以P3A和P3B花药的cDNA以及P3B的总DNA为模板，以MYB21-R和MYB21-F为引物，克隆MYB21基因的全长，得到的克隆片段分别命名为P3A-MYB21（RNA），P3B-MYB21（RNA）以及P3B-D-MYB21（图 2）。

将MYB21基因的cDNA序列和DNA序列用DNAMAN软件进行比对，发现MYB21基因在cDNA和总DNA水平其核苷酸同源性达到83.21%，其中MYB21基因在不育系P3A和保持系P3B的cDNA水平上序列是一致的，它们的全长均为922 bp，开放阅读框为843 bp，编码280个氨基酸，而总DNA序列则包含3个外显子和两个内含子，其全长为1 108 bp。ATG为起始密码子，由下图可知第1个外显子为155 bp，第2个外显子129 bp，第3个外显子559 bp，3个编码区序列总长为843 bp，第1个内含子89 bp，第2个内含子97 bp，两个非编码区总长为186 bp（图 3）。序列提交到NCBI，提交的DNA序列号为：KT898146。

利用ORF finder 寻找扩增产物的最长ORF，在NCBI进行保守结构域搜索，结果（图 4）显示所扩增的产物序列包含两个SANT结构域，即MYB超级家族的典型保守结构域，说明所克隆得到MYB21基因是属于R2R3型MYB转录因子基因。

另外，将MYB21基因所编码的氨基酸序列与其他物种中的氨基酸序列进行比对发现，MYB21基因与雷蒙德氏棉的MYB108-like基因以及陆地棉中的MYB5基因同源性较高，序列同源性分别达到67%和63%（图 5）。

2.3 红麻MYB21基因载体的构建 2.3.1 表达载体的构建

将用加入酶切位点的MYB21基因引物克隆所得的基因片段与PBI121-GFP载体双酶切之后进行连接，利用PBI121载体序列所设计的引物进行菌液测序测序结果与目的基因序列通过DNAMAN进行比对（图 6），发现测序序列包含完整目的基因序列。

同时进行酶切验证，酶切下来的片段大小与目的片段大小一致（图 7）。证明目的基因片段成功连接到表达载体中，将构建成功的表达载体命名为PBI121-MYB21。

2.3.2 干扰载体的构建

红麻MYB21基因扩增片段大小与所选取的干扰片段大小一致，均在400 bp左右（图 8-A），双酶切RNAi-Z和RNAi-F得到的片段长度（图 8-B）经菌液测序其结果与所选取的正向片段和反向片段序列一致，这充分说明了正向片段与反向片段成功连接到了pMD19-T载体上。对PK-R1和PK-R1-F2分别进行双酶切，所获得的酶切片段与干扰片段长度一致（图 8-C），说明干扰片段连接到中间载体PKANNIBAL成功。最后，对pART27-PK-R1-F2用Not Ⅰ酶切，并以pART27-PK-R1-F2质粒做对照，凝胶电泳图结果（图 8-D）显示酶切下来的片段与目的片段大小一致，同时利用PKANNIBAL载体序列的通用引物进行菌液测序，测序结果（图 9）显示所插入的片段与目的片段碱基序列一致，说明干扰片段成功连接到相应载体上。

2.4 MYB21基因荧光定量分析

本研究从红麻不育系材料P3A和保持系材料P3B的根、叶和花药中提取总RNA，进行反转录，通过荧光定量PCR反应，运用双标准曲线法分析反应数据来研究MYB21基因在两者之间不同组织器官的表达量情况。以管家基因GAPDH和MYB21基因的5个梯度浓度标准品、阴性对照和待测样本分别设置3个重复同时上机，获得GAPDH和MYB21基因的扩增曲线和标准曲线。结果显示阴性对照没有检测到荧光信号，融解曲线峰形单一，管家基因和MYB21基因的标准曲线相关系数的R²＞0.999，表明荧光定量反应体系没有污染，引物特异性好，且重复性较高，由此得出的荧光定量的实验数据具有可靠性与真实性。

定量分析结果（图 10-A）表明MYB21基因在不育系花药中的表达量极显著低于保持系，仅为保持系的0.07倍，在根中表达量下调为0.28倍，而在叶片中的表达量略微高于保持系（1.41倍）。比较分析保持系的根、叶和花药中的定量数据，发现MYB21基因主要在花药中表达（图 10-B）。

3 讨论

MYB类转录因子是植物中最为重要的一类转录因子，在植物生长发育中扮演着重要作用。Shin等^[12]研究发现拟南芥中MYB21基因特异性在花中进行表达，Li等^[13]利用RT-PCR技术分析了AtMYB57、AtMYB21、AtMYB24、AtMYB116和AtMYB62在拟南芥根、莲座叶、茎生叶、花和角果中的表达量，其中MYB21基因在拟南芥各个部分都有一定量的表达，但主要是在花中进行表达。Yang等^[14]研究发现与AtMYB21氨基酸序列同源性达68.5%的AtMYB24也是主要在花中表达。本研究首次从红麻中克隆到转录因子MYB21，并明确了其序列结构，进一步分析了其表达模式，与前人研究结果相似，发现该基因主要在红麻花药中表达，在根和叶中只有轻微的表达。而且在不育系花药中呈现极显著下调表达模式，因此推测该基因可能参与了红麻花药发育的调控。

Song等^[5]研究了MYB21基因在转基因拟南芥中表达量情况，当转基因植株MYB21的表达水平是野生型拟南芥中的20-100倍时，植株出现严重或完全丢失育性，而表达量是野生型1-5倍时，转基因植株其育性改变不明显，这说明了MYB21基因的表达量水平的高低对于雄蕊发育是很重要的。因此后续研究可以将构建的过表达载体和干扰载体进行转基因实验，在鉴定载体构建成功的同时，一方面，将构建的过表达载体通过花粉管通道注射红麻或叶盘法转烟草研究MYB21基因与植物育性的关系，而且构建的过表达载体以本实验室改造过的含有绿色荧光蛋白的PBI121为载体，为后续转基因验证该基因的功能及亚细胞定位提供便利。另一方面，结合RNAi载体所具有的特异性沉默某个基因表达的特性，将构建的干扰载体进行同样的转基因实验，从反向遗传学角度出发充分研究MYB21基因的功能。

另外，转录因子是通过结合到靶基因而发挥作用的，Shin等^[12]发现拟南芥MYB21可以直接调节苯丙氨酸裂解酶PAL和交替氧化酶AOX1a的表达，从而发挥调控苯丙氨酸的代谢过程。Song等^[5]研究发现MYB21和MYB24与JAZ 蛋白结合影响花药发育和花丝延长，并且推断MYB21和MYB24是与JAZ蛋白分离之后激活下游各种不同的基因来参与这个过程的。因此后续研究拟进一步筛选MYB21靶基因并分析靶基因的表达模式，从而揭示MYB21在调控红麻CMS发生的作用。

4 结论

成功克隆了红麻不育系P3A和保持系P3B中的MYB21基因，明确了MYB21基因序列结构；分析了MYB21基因在不育系和保持系各组织器官的表达模式，研究发现MYB21基因主要在花药中进行表达，并且两系之间表达量呈极显著差异；经过酶切和测序验证，过表达载体和干扰载体构建成功，能够用于后续转基因功能研究。