目前实时荧光定量PCR技术主要分为染料法和探针法^[1]。染料法是在PCR体系中加入能结合双链核酸分子发光的荧光染料，因此其面临着非特异性扩增产物尤其是引物二聚体（primer dimer，PD）引起的假阳性问题^[2-5]。TaqMan探针法中探针的引入绕过了PD引起的假阳性问题，但其干扰作用仍存在，PD可以通过竞争性抑制作用使浓度对应Ct值在34以后的靶模板无法扩增而出现假阴性问题^[6]。一般认为，探针法的假阴性问题主要由抑制剂引起，为排除假阴性，现多采用加入内标系统作为内质控的双重PCR体系完成定量检测^[7-11]。内标系统的加入，在一定程度上排除了假阴性问题，同时提升了检测的灵敏度^{[12, 13]}，但内标系统也增加了反应体系的复杂程度，将单重PCR中由引物探针聚合延伸和气雾胶污染引起的假阳性问题进一步加重^{[14, 15]}。

现阶段探针法中使用较多的为5'端标记荧光基团3'端标记淬灭基团的TaqMan探针，在反应过程中，探针先于引物结合到模板上，伴随引物延伸被Taq酶水解而发光，该类型设计简单但探针荧光本底较高。对此，分子信标则是在寡核苷酸两端人为添加了一段互补的序列形成含有自身茎环结构的探针，利用构象的变化完成荧光的读取，但由于茎部不与模板结合，在一定程度上降低了探针与模板的结合效率，使体系整体表现出的扩增效率较低^[16]。为了提升探针与模板的结合力，锁核酸、肽核酸等有了一定程度的应用，但尚未有针对引物探针聚合问题在探针中引入新型碱基的研究^[17]。

本研究首先使用不同的引物和探针进行无模板的聚合实验；然后以乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）为靶模板，在TaqMan-分子信标的基础上，设计不同类型的探针对不同反应条件下假阳性积累情况进行比较，并进一步使用引入反义碱基的改良TaqMan-分子信标探针作比对，用于印证新型探针的实用性；对于PD引起的假阴性问题，则在使用中部同序引物的基础上，根据竞争性和非竞争性双重PCR的干扰关系选择浓度适宜的管家基因作内标，并设计干扰实验用于澄清内标系统提升检测灵敏度的机制，以期了解决引物探针聚合延伸引起的假阳性问题和由PD干扰引起的假阴性问题。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂

5 mmol/L dNTPs（U代替T），5 U/μL Taq DNA聚合酶，10×buffer（10 mmol/L Tris HCl，pH 8.3,1.6 mmol/L MgCl₂,50 nmol/L KCl，20%葡聚糖），PCR增效剂，dH₂O，乙肝质粒。以上试剂均由北京泰格瑞分子检验有限公司提供。

1.1.2 仪器

SLAN实时荧光定量PCR仪购自上海宏石有限公司。

1.1.3 引物和探针设计

以HBV DNA作为研究对象，从GenBank中获取其全基因序列，通过序列比对，选择其核心C区的一段高保守序列作为靶模板，利用引物和探针设计软件DNAMAN和Primer Premier 5设计引物对。并设计普通TaqMan-分子信标探针HBVcP1，序列调整的改良TaqMan-分子信标探针HBVcP2和HBVcP3以及含有反义碱基的改良探针HBVcP4（图 1），以BLAST中随机的基因序列设计探针P1和P2，各探针序列见表 1。并选择不同基因作为靶序列设计各引物。

1.2 方法 1.2.1 假阳性和探针改良 1.2.1.1 引物探针聚合实验

（1）同探针不同引物：为了找出决定引物探针聚合的关键因素，分别对P1和P2使用一对和两对不同的引物对进行引物探针聚合实验，50 μL反应体系，使引物的终浓度为0.1 μmol/L，探针的终浓度为0.05 μmol/L。（2）同引物不同靶探针：现在多采用仪器热盖和矿物油封闭的策略用以保证反应液不挥发和光路通畅。在找出影响引物探针聚合的主要因素之后，为了验证改良探针的实用性和优选矿物油、热盖的应用，分别使用相同的引物，对4种HBV靶探针在热盖、矿物油封闭加热盖和矿物油封闭不加热盖3种条件下进行连续重复聚合实验。

1.2.1.2 四种靶探针性能比较

（1）淬灭效率测定：分别借助50 μL反应体系检测HBVcP1、HBVcP2、HBVcP3和HBVcP4的淬灭效率，重复检测3次，计算结果。（2）灵敏度比较：分别使用HBVcP1、HBVcP2、HBVcP3和HBVcP4对系列稀释的HBV质粒模板进行测定，反应条件如前，记录其扩增曲线。

1.2.2 假阴性和引物改良

对于TaqMan探针法中的假阴性问题，现多采用加入内标组成双重PCR的方式，为了选择内标系统的类型和体系浓度，分别对竞争性和非竞争性双重PCR作干扰实验。在同一反应体系中，竞争性双重PCR为靶模板和内标基因共用同一对引物，非竞争性双重PCR则是指靶模板和内标基因使用不同的引物对。

1.2.2.1 竞争性双重PCR干扰实验

选择乙肝表面抗原基因质粒和其突变模板，分别设计不同探针，使用相同引物进行干扰实验。

1.2.2.2 非竞争性双重PCR干扰实验

选择HBV表面抗原质粒作为靶模板，突变HBV核心区模板作为内标基因，二者使用不同引物对，进行干扰实验。

1.2.2.3 内标基因的选择及克隆

查取多种管家基因序列，分别设计引物检测其天然浓度，选择合适管家基因作为内标基因，根据其基因序列设计克隆引物完成克隆，并对克隆产物进行基因测序。

1.2.2.4 中部同序引物实用性验证

对选定的内标基因设计中部同序引物对和普通引物对以及探针，检测10倍系列稀释的内标质粒，50 μL反应体系：5 μmol/L上下游引物各1 μL、2.5 μmol/L内标探针1 μL、5 mmol/L dNTP 1 μL、Taq酶2 μL、10×buffer 5 μL、PCR增效剂2 μL、dH₂O 27 μL，50 μL矿物油封闭后上机检测。反应程序如下：95℃ 2 min，50℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 60 s，进行45个循环，58℃处读取荧光。

1.2.2.5 双重PCR内标引物和探针浓度优化

在确定靶引物浓度为5 μmol/L、靶探针浓度为2.5 μmol/L的前提下，对引物和探针的浓度进行系列优化。

1.2.3 不同体系检测HBV梯度比较

对HBV阳性血清标准品提取DNA进行2倍倍比稀释，分别使用探针法结合普通引物对、普通引物对加内标和中部同序引物对种3体系检测；并使用染料法检测3种体系PD形成情况。

2 结果 2.1 引物探针聚合实验结果 2.1.1 同探针不同引物

分别对探针P1和P2使用一对和两对不同引物进行聚合实验，结果如表 2所示，对于探针P1，不同的引物对均出现了假阳性，Ct值大小不等；而对于探针P2，各引物对均未出现假阳性。

2.1.2 四种靶探针与靶引物假阳性测试

分别使用4种靶探针和同一对靶引物在热盖、矿物油加热盖及矿物油无热盖3种条件下进行假阳性聚合实验，并同时检测另外加入引物对的假阳性情况，结果如表 3所示。HBVcP1和HBVcP2开始即产生假阳性，并随着实验次数的增多逐渐加重；HBVcP3开始的时候不出现假阳性，随着重复假阳性逐渐产生；含有反义碱基的探针HBVcP4始终没有出现可检测到的假阳性（图 2）。

单独使用矿物油严重程度低于其他两组（图 3）。另外，引物和探针聚合产生假阳性的荧光曲线的荧光值较低，随着重复实验的积累，其扩增曲线的荧光强度逐渐增加。

2.2 不同探针性能比较 2.2.1 淬灭效率测试

分别对HBVcP1、HBVcP2、HBVcP3和HBVcP4检测淬灭效率，计算公式为Eff=[1-（Fq-Fb）/（Fuq-Fb）]×100%^[18]，其中Fq为探针自身的荧光强度，Fuq为探针水解之后的荧光强度，Fb为反应液自身的荧光强度。结果（表 4）显示，4种探针淬灭效率都较高。

2.2.2 灵敏度比较

使用4种探针对系列稀释度的HBV质粒模板进行检测，记录扩增曲线并对各探针的荧光强度进行比较，重复检测3次，其荧光强度无明显差别。如表 5所示，各探针检测灵敏度在同一数量级。

2.3 假阴性和引物改良 2.3.1 竞争性双重PCR干扰实验

分别对乙肝表面抗原基因质粒和其突变模板设计探针，使用相同引物在同一反应管进行扩增。结果（表 6）显示，使用竞争性内标基因时，将靶模板作稀释，控制内标模板浓度在Ct30左右。当二者浓度相差10-20倍时出现干扰，相差50倍时严重抑制，相差100倍时低浓度模板会彻底抑制。

2.3.2 非竞争性内标干扰实验

选择HBV表面抗原质粒作为靶模板，HBV核心抗原质粒作为内标基因，二者使用不同引物对，进行干扰实验。结果（表 7）显示，当靶模板与内标模板浓度相差超过100倍时，基本没有影响或出现一些较小干扰，当二者浓度相差超过1 000倍时，开始出现较严重的干扰作用。

2.3.3 内标基因的选择及克隆

分别针对各管家基因设计引物，使用染料法检测其浓度，为了保证数个靶模板完成准确定量（Ct约36），根据结果（未呈现）选择浓度对应Ct值在30左右的β-globin做为内标基因，克隆后对克隆产物进行测序，与BLAST中的基因序列进行比对，符合率100%（图 4）。

2.3.4 中部同序引物验证

使用中部同序引物对和普通引物对结合探针检测系列稀释的β-globin模板，结果显示，普通引物对可以检测到10-8稀释度（图 5-A），中部同序引物对可以检测到10-9稀释度（图 5-B），TaqMan探针法中使用中部同序引物对检测灵敏度相比于普通引物对好一个数量级。

2.3.5 双重PCR体系内标引物和探针浓度优化

在确定靶引物浓度为5 μmol/L、靶探针浓度为2.5 μmol/L的前提下，对系列浓度的引物和探针进行优化。结果显示，当内标引物浓度为4 μmol/L、内标探针为2.5 μmol/L时，对确定浓度的靶模板扩增有最小的Ct值和最大的荧光增值。

2.4 不同体系检测灵敏度比较

对HBV阳性血清标准品提取DNA进行2倍倍比稀释，分别使用探针法联合普通引物对、普通引物对加内标和中部同序引物对进行检测。检测结果如表 8所示，对于单重TaqMan探针法检测体系，同β-globin，使用中部同序引物对灵敏度较普通引物对提升近一个数量级。对于普通引物对，引入内标系统之后增加了检测的灵敏度。但PD含量有所增加，Ct值由31.34变为30.07。

3 讨论

TaqMan探针法实时荧光定量PCR的使用，使分子检测技术的实用性得到了进一步的提升，但该方法也存在普通检测技术面临的非特异性问题。在这一反应体系中引物和探针聚合延伸产生的假阳性则是其非特异性问题的主要来源之一。

使用相同的引物与不同的探针进行聚合实验，结果显示有的探针在首次检测即出现假阳性，而有的探针是随着实验次数的增多积累产生假阳性；使用相同的探针分别与不同的引物聚合则显示不同的引物之间结果较一致。两对引物与探针聚合扩增，相比于一对引物，既存在加重的现象，又存在抑制的现象。这说明引物和探针之间能否聚合更多取决于探针，引物也有一定的影响。另外，引物和探针聚合的初期扩增曲线荧光值较低，但Ct值多在32-36之间，随着实验次数的增多，其荧光强度逐渐增加，Ct值也逐渐减小。对于存在假阳性问题的探针，可以对其序列结构在TaqMan-分子信标（HBVcP1）的基础上调整（HBVcP2、HBVcP3），同时引入反义碱基（HBVcP4）用以杜绝引物和探针聚合的现象。分别使用一对引物和两对引物对4种探针在不同条件下进行了引物探针聚合实验。说明相对于原始结构的TaqMan-分子信标，结构调整的改良探针对于减少假阳性问题更有意义；在一段核酸序列中，反义碱基可以被Taq酶水解但不可以作为扩增的模板，其应用则彻底解决了引物和探针聚合延伸的问题。结构调整的HBVcP2与原始探针HBVcP1假阳性情况相当，说明探针3'端添加序列与自身互补的位置同样重要，互补部位不合适并不能杜绝假阳性问题。而对4种探针的性能验证结果表明，探针中反义碱基的使用，在排除假阳性问题的同时，还保证了探针的淬灭效率、反应体系的扩增效率和灵敏度，这无疑显示了其强大的优势。

在实时荧光定量PCR检测中，为了确保反应液不蒸发和仪器光路通畅，多使用仪器热盖或矿物油封闭的策略^{[19, 20]}。在进行引物和探针聚合实验时，分别在使用仪器热盖、矿物油加热盖和矿物油无热盖的条件下进行重复，发现单独使用矿物油的假阳性积累速度比矿物油加热盖更慢。所以，对于TaqMan探针法，单独使用矿物油封闭反应液而不使用仪器热盖是保证检测结果准确性的前提条件。

另外，对于TaqMan探针法中面临的引物二聚体引起的假阴性问题，现在更多的使用加入内标作为内质控的方法^{[21, 22]}。两种类型双重PCR干扰实验结果显示，使用非竞争性双重PCR内标基因和靶模板的相互干扰更弱；为了保证数个靶模板的准确定量，应选择浓度对应Ct值在30左右的管家基因β-globin作为内标基因。对于β-globin基因，使用中部同序引物对联合探针，其检测的灵敏度相比于普通引物对好一个数量级，无疑说明染料法中解决PD问题的中部同序引物对在探针法中同样适用。

在完成靶模板内标系统双重PCR体系的优化之后，使用普通引物对、普通引物对加内标系统、中部同序引物对3种检测体系对系列稀释的HBV标准品进行检测。类似于β-globin基因，使用中部同序引物对检测的灵敏度高于普通引物对。对于普通引物对体系，内标系统的引入，提升了对HBV检测的灵敏度，而PD的含量有所增加。这说明，引入内标系统之后，增加了反应体系中引物二聚体的总量，但分散了与靶模板存在竞争性抑制作用的PD的指数性，使其干扰作用推后，从而提升了检测的灵敏度。因此，对于TaqMan探针法中的假阴性问题，使用中部同序引物对和加入内标系统的策略均可以降低其产生。

4 结论

本研究通过研究引入反义碱基的TaqMan分子信标探针，解决了在探针法实时荧光定量PCR中由引物和探针聚合引起的假阳性问题。通过内标基因和靶模板的相互干扰关系选择β-globin作为内标基因，在验证中部同序引物实用性的同时，指出了其提升检测灵敏度的真正机制。此外，通过不同条件下的引物探针聚合实验发现单独使用矿物油封闭反应液而不使用仪器热盖是保证检测结果准确性的前提条件。