苹果树腐烂病、梨枝枯病、杨树溃疡病等枝干皮层病害严重影响树木的生长，甚至导致植株的死亡。目前对此类病害的防治以施用化学药剂为主，但该方法易引发农药残留、环境污染、病原物产生抗药性等问题。20世纪80年代，微生态防治在植物病害防治中兴起^[1]。植物微生态学是研究植物内微生物的组成、功能、演替、微生物互作及其与寄主间相互关系的生命分支。以往人们采用纯培养技术研究微生物的种群结构，但环境中大多数微生物处于存活但不能培养的状态^[2]。Illumina公司的MiSeq、Roche公司的454等第二代测序技术直接提取微生物环境宏基因组DNA，扩增微生物保守区域内的序列可变区进行高通量测序、比对、分析，为研究环境微生物组成提供了新的手段^[3]。例如Sun等^[4]利用16S rDNA V1-V3区高通量测序技术研究施用生防菌Phlebiopsis gigantea后挪威云杉树桩内细菌群落的变化。若要使用高通量测序技术研究树皮内微生物组成，进而借助微生态理论防治枝干皮层病害，提取高质量的树皮宏基因组DNA是首要任务。另外，以植物树皮为材料提取遗传物质，可以降低空间和季节等因素对取样的限制，为植物分子生物学研究提供便利条件。

目前人们已成功地从植物叶片、果实等材料中提取出DNA^{[5, 6]}。植物DNA的提取方法有很多，传统的方法有CTAB法和SDS法，国内外生物公司还开发了多种商品化的植物DNA提取试剂盒，但由于不同植物中次生代谢产物的种类和含量差异很大，有时同种植物不同器官或组织的次生代谢产物的种类和含量也不一样，使得针对某种材料优化的DNA提取方法不一定适用于其它材料^[7]。枝干树皮组织厚且硬，富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次生代谢物质，用简易CTAB法分离出的DNA因多酚氧化而呈褐色，多糖、单宁等物质与DNA结合成黏稠的胶状物，用改良的CTAB法^{[8, 9]}、常用的SDS-CTAB结合法^{[10, 11, 12]}以及天根植物DNA提取试剂盒也不能避免多糖与核酸共沉淀，提取的基因组DNA纯度低，不能进行稳定的PCR扩增和限制性酶切反应。因此本研究继续尝试整合多步除杂步骤，旨在得到一种适合提取多种枝干树皮高质量DNA的方法，为应用高通量测序技术研究树皮内微生物组成和其他植物分子生物学研究提供参考。

试验样品：苹果树皮、杨树树皮、梨树树皮、柳树树皮和枣树树皮采自西北农林科技大学经济树木园和周边村落。样品采集后4 h内经液氮冷冻后贮存于-80℃冰箱。

仪器：Thermo 702超低温冰箱，海门其林贝尔QL-901漩涡混合器，精宏XMTE 8112水浴锅，Eppendorf 5810R高速冷冻离心机，Thermo NanoDrop 2000分光光度计，Bio-Rad S1000^TM Thermalcycler PCR仪，JUNYI JY600c电泳仪，Gene Genius Bio-imaging System凝胶成像系统。

试剂：PCR buffer、MgCl₂和dNTPs等PCR反应试剂购自TaKaRa，Taq DNA聚合酶、限制性内切酶Hind Ⅲ、限制性内切酶EcoRⅠ等购自Thermo scientific，2×Es Taq MasterMix、RNase A购自康为世纪，16S引物由北京华大基因合成，引物MdPDIF、MdPDIR、MdBipF、MdBipR由Invitrogen公司合成，DNA Marker购自Vazyme，其他化学试剂为国产分析纯。

缓冲液BufferⅠ：200 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），50 mmol/L EDTA（pH8.0），250 mmol/L NaCl，0.5% β-巯基乙醇。

2% SDS缓冲液：2% SDS，2% PVP，1 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），50 mmol/L EDTA（pH8.0）。

2% CTAB缓冲液：2% CTA，2% PVP，1.4 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），20 mmol/L EDTA（pH8.0）。

实验首先以苹果树皮为材料，主要参考文献^{[7, 8, 9, 10, 11, 12]}探索适合苹果枝干树皮DNA的提取方法，之后用得到的方法提取杨树、梨树、柳树、枣树树皮宏基因组DNA，观察该法通用性。具体步骤为：（1）取约1 g于-80℃保存的苹果树皮和0.1 g PVP放入预冷的研钵中，加液氮用研杵碾压样品，待剩余少量液氮时快速用力研磨，重复研磨3-4次，将适量彻底研碎的细粉迅速转移至2 mL离心管（管中体积约1 mL），加入1.5 mL BufferⅠ涡旋混匀后冰浴10 min，期间不时摇匀。（2）4℃，5 000×g离心10 min，弃上清，沉淀中加入700 μL 65℃预热的2% SDS缓冲液和100 μL β-巯基乙醇混匀，65℃水浴1 h。（3）加入300 μL 5 mol/L KAC（pH6.0），混匀后-20℃放置1 h。（4）4℃，12 000×g离心10 min，取上清，加入1/5体积65℃预热的2% CTAB缓冲液，混匀，65℃水浴40 min。（5）冷却至室温，加入1/2体积酚∶氯仿∶异戊醇抽提2次，每次5 min。（6）4℃，12 000×g离心10 min，取上清，加入1/2体积5 mol/L NaCl 和等体积异丙醇，混匀后-20℃放置4 h。（7）4℃，12 000×g离心10 min，弃上清，70%乙醇洗涤沉淀两次，每次10 min，过夜风干沉淀，加100 μL灭菌水，37℃水浴2 h溶解DNA后加入0.5 μL RNase A（10 mg/mL），37℃过夜，最后置4℃冰箱备用，若长期保存应放于-80℃。

分别取1 μL苹果树、杨树、梨树、柳树和枣树树皮DNA，用Thermo NanoDrop 2000分光光度计测定各样本DNA的浓度及A₂₆₀/A₂₈₀和A₂₆₀/A₂₃₀值。

取8 μL DNA样品与1 μL 10×loading buffer混合，90 V电压下1%琼脂糖凝胶中电泳50 min，溴化乙锭染色，Gene Genius Bio-imaging System凝胶成像系统中观察并拍照。

选择限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ分别酶切5种树皮DNA。采用10 μL反应体系，其中DNA样品2.5 μL，限制性内切酶1 μL，10×buffer 1 μL，灭菌水5.5 μL。37℃放置2 h，90 V电压下1%琼脂糖凝胶中电泳检测酶切情况。

rRNA基因序列 分别以5种树皮DNA为模板，用16S通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'扩增苹果树、杨树、梨树、柳树、枣树树皮环境中细菌的16S rRNA基因。扩增体系为25 μL，其中10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl₂ 2 μL，10 μmol/L 引物各0.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.4 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，灭菌水18.4 μL，模板DNA 0.5 μL。所用PCR扩增程序为：95℃预变性10 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，34个循环；最后72℃延伸10 min。取8 μL PCR产物与1 μL 10×loading buffer混合，90 V电压下1%琼脂糖凝胶中电泳检测扩增情况。

以苹果树皮DNA为模板，用两对引物MdBipF：5'-ACACCATGGCTGGCT-CTTG-3'；MdBipR：5'-TTAAAGCTCGTCATGCGAC-TC-3'和MdPDIF：5'-TATGGCGTCGTCTTCTAGGGT-3'；MdPDIR：5'-CGTTAGAGGCTCCATCCTTTCCG-3'分别扩增苹果Bip和PDI基因，扩增体系为25 μL，其中2×Es Taq MasterMix 12.5 μL，灭菌水12 μL，模板DNA 0.5 μL。所用扩增程序同1.2.2.4，取5 μL PCR产物，90 V电压下1%琼脂糖凝胶中电泳检测扩增情况。

将6份苹果树皮宏基因组DNA送北京诺禾致源公司，经电泳检测合格后，以该DNA为模板扩增树皮环境中细菌16S高变区，判断 DNA质量是否满足后续建库测序需求。

用分光光度计测定DNA的浓度和纯度，高纯度DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值应在1.8-2.0之间，A₂₆₀/A₂₃₀的数值处于2.0左右时，表明小分子盐离子、色素、多糖或醇等杂质含量较少。表 1显示，5种植物树皮的宏基因组DNA产量满足常规实验需求，且纯度很高。

表 1 五种树皮DNA的浓度及纯度值

表选项

琼脂糖凝胶电泳（图 1）显示，5种树皮DNA各显示出一条高分子量条带，点样孔较干净，均无明显的拖尾现象，说明5种DNA都相对完整，多糖等杂质去除干净，DNA稳定无降解。

M：1 kb DNA Marker；1-5：依次为苹果树、杨树、梨树、柳树和枣树树皮DNA 图 1 五种树皮基因组DNA电泳图

图选项

图 2显示，5种DNA都能被HindⅢ和EcoRⅠ识别并在2 h内切割完全。说明所提DNA纯度高，抑制内切酶活性的多糖等杂质含量很少。

1-5：依次为苹果树、杨树、梨树、柳树和枣树树皮DNA Hind Ⅲ酶切图；6-10：依次为苹果树、杨树、梨树、柳树及枣树树皮DNA EcoRⅠ酶切图 图 2 五种树皮基因组DNA限制性内切酶酶切图谱

图选项

以5种树皮DNA为模板，用16S引物扩增细菌16S rRNA基因PCR产物电泳及以苹果树皮DNA为模板扩增Bip和PDI基因，结果（图 3）显示，所有扩增产物主条带明亮清晰，16S rRNA基因大小为1 500 bp左右，Bip和PDI基因3 000 bp以上，符合相应片段特征。此项结果进一步证明该方法提取到高质量的树皮宏基因组DNA。

M1：2 000 bp DNA Marker；1：以水为模板的扩增产物；2-6：依次为以苹果树、杨树、梨树、柳树及枣树树皮DNA为模板的16S rRNA基因扩增产物；M2：1 kb DNA Marker；7：Bip基因；8：PDI基因 图 3 五种树皮内细菌16S rRNA基因（A）及苹果Bip和PDI基因扩增产物（B）电泳图

图选项

经检测，本研究方法提取到的苹果树皮宏基因组DNA电泳条带整齐明亮，送样过程中略有降解，以此DNA为模板扩增到的16S rRNA基因V4+V5高变区序列为A级，即PCR产物目的条带单一（图 4），大小正确，总量满足两次或者两次以上建库需要。综合各项指标确定该宏基因组DNA质量合格，可不经PCR扩增而直接用于后续建库测序。

M：100 bp DNA Marker；1-6：苹果树皮内细菌V4+V5区PCR产物，上样3 μL 图 4 苹果树皮内细菌16S rRNA基因V4+V5区PCR产物电泳图

图选项

提取高质量的枝干树皮宏基因组DNA是应用高通量测序技术研究树皮内微生物组成，进而借助微生态理论防治枝干皮层病害的前提，以树皮为材料提取遗传物质还可以使取样免受空间和季节等因素的限制，为限制性酶切、PCR扩增等植物分子生物学研究提供便利。从当前发表的植物DNA 提取文献看，各种方法的建立大多基于CTAB和SDS两种提取技术之上，但由于提取对象、缓冲液成分及提取步骤的差异，使得 DNA 提取效果不尽相同^[13]。顽拗型枝干树皮材料厚且硬，富含干扰DNA提取的次级代谢产物，需要更完善的提取操作才能得到质量合格的DNA。

研磨好的材料中加入洗涤液BufferⅠ，洗去了大量色素等杂质，减轻后续除杂过程的负担。为了去除植物中的酚类物质，防止其氧化变褐后与核酸不可逆结合，普遍是在研磨时或提取液中加入适量的高分子螯合剂PVP和抗氧化剂β-巯基乙醇，也可以用TCEP、抗坏血酸、硼砂等试剂抑制氧化反应，避免DNA褐化^[14]。适当地提高β-巯基乙醇的量还能有效去除多糖等次生物质^[15]。SDS在高温（55-65℃）条件下能裂解细胞，同时与蛋白质和多糖结合成复合物，释放出核酸，之后加入高浓度KAc或NH₄Ac低温放置，使形成的复合物转变为溶解度更小的钾盐形式，沉淀更加完全，离心后除去^[16]。CTAB能与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7 mol/L）浓度下可溶，并稳定存在，经过酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提去除蛋白质、多糖、色素等杂质，最后用异丙醇或乙醇将DNA沉淀出来，离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70%酒精浸泡可洗脱掉CTAB^{[17, 18]}。

植物组织往往富含多糖，多糖污染是提取植物DNA时遇到的最棘手的问题。多糖的许多理化性质与DNA很相似，所以很难将它们分开。Dellaporta等^[19]认为加入高浓度的KAc有利于除去多糖；Fang等^{[20, 21]}认为在1.0-2.5 mol/L NaCl的高盐TE中，用无水乙醇沉淀DNA能除去多糖。

以往在提取植物DNA时，大多选用植物叶片等材料，选取以上操作的几个方面即可满足植物分子生物学的要求^{[5, 7, 9, 18, 21]}。本研究的目的是得到适用于高通量测序的枝干树皮宏基因组DNA，对DNA质量要求较高，又因枝干树皮属顽拗型植物材料，实验综合多步抑制多酚氧化、除蛋白、除多糖等处理，才得到质量合格的基因组DNA且该DNA适用于普通植物分子生物学研究。研究中发现，略去DNA提取过程中洗涤、加KAc -20℃放置、加CTAB 65℃水浴、沉淀时加NaCl、DNA完全溶解后加RNase A中的任何一步操作，都会影响DNA的质量和稳定性，其中KAc和RNase A处理是至关重要的两个步骤，分别对所提DNA的纯度和稳定性起着决定性的作用。使用本实验方法提取5种树皮DNA，产量差异较大，可能与植物本身特性有关。

本研究得到一种适合多种枝干树皮基因组DNA的提取方法，该法操作简单，所用试剂廉价易得，仪器常见，所得5种树皮DNA完整性好，纯度高，苹果树皮DNA满足高通量测序法研究微生物多样性对环境宏基因组DNA的要求。经PCR扩增苹果基因和5种树皮内细菌16S rRNA基因及酶切实验验证，此方法得到的DNA也适用于植物分子生物学研究。