近年来随着石化原料的逐渐短缺和由此带来的环境恶化等问题，利用可再生资源为原料加工生产化学品可以从源头解决资源短缺和环境污染问题，实现可持续发展。目前市场上销售的四甲基吡嗪主要是化学法合成的，普遍存在污染环境问题。而生物发酵生产的2，3，5，6-四甲基吡嗪（2，3，5，6-Tetramethylpyrazine，TTMP）虽然价格昂贵，但消费者更倾向于这种天然TTMP产品。直接从植物中提取TTMP，因植物中含量少提取率不高而没能实现工业化，利用微生物发酵工程合成天然TTMP则具有良好发展前景成为研究焦点。
本文将从TTMP的生产现状和合成机理出发，结合本课题组前期的研究成果，综述微生物发酵生产TTMP取得的进展与成就，包括菌种的发现与改造、发酵过程的培养基优化与过程控制、高效分离提取工艺等方面，旨为后续有关提高TTMP产量的研究究提供参考。
1 TTMP的用途和生产现状 1.1 TTMP的用途TTMP是一类含氮的杂环化合物，具有烘烤和坚果的特殊香味[1]，其香味阈值极低，被广泛应用于食品添加剂。TTMP天然存在于乳制品、豆制品、榛子、醋、面包、酒精类饮料和咖啡等食品中[2, 3]，赋予其特殊香味。影响微生物发酵生产TTMP的一种重要中间产物是乙偶姻，即3-羟基-2-丁酮，乙偶姻具有令人愉悦的奶油香气，作为食品香味添加剂被广泛应用[3]，但乙偶姻的分离提取较困难。
TTMP不仅用作食品、饮料等行业的香味添加剂，在医学上TTMP是中草药川芎根茎的主要活性生物碱成分，具有扩张血管、抑制血小板黏附聚集和血栓形成等良好的药理作用[4]，是重要的医药中间体，引起国内外学者的广泛关注。随着对TTMP研究的深入，发现其在治疗心脑血管疾病、呼吸系统疾病和肾小球疾病等方面具有一定疗效[5, 6, 7, 8]。中国白酒在制曲和堆积发酵中产生四甲基吡嗪，经蒸馏带入酒中，赋予中国白酒以健康功能[9]。食醋在发酵和储存过程也能产生吡嗪[10]，使其具有降血糖血脂及促进钙的吸收等功效[11, 12, 13]。
1.2 微生物发酵生产TTMP现状生产TTMP的方法主要有直接从植物中提取、化学合成和生物合成3种。直接萃取法由于提取原料来源有限，且在原料中TTMP含量少，提取产量低，不适合工业化生产。TTMP的化学合成法的化学合成成本较低，但原料来源短缺和易造成环境污染，且反应一般较剧烈，对设备要求也较高[14, 15, 16, 17, 18]。微生物发酵法生产TTMP，主要以糖为碳源，经微生物发酵和化学反应制得天然TTMP，已知能生产TTMP的菌种包括谷氨酸棒状杆菌突变菌株[19]、乳酸杆菌[20]和芽孢杆菌及其突变菌株[21]，其中以芽孢杆菌液态发酵产量最高，研究最多。生物合成法优点在于原料来源广、反应条件温和、环境污染小、产品绿色天然，缺点是产量较低、价格高。
利用微生物发酵生产TTMP的相关研究起步较晚，生物合成途径生产TTMP的技术远未成熟。1993年，Yamaguchi等[22]以葡萄糖为碳源利用Bacillus natto液态发酵产生的总吡嗪量为42 mg/L。Besson等[23, 24]通过向固体培养基中添加乙偶姻来提高TTMP产量，虽然TTMP产量明显提高，最终产量也仅为0.58 g/L，对于实现工业化生产来说，TTMP产量仍很低。由此可见，直接利用野生菌发酵生产TTMP的产量较低。为进一步提高微生物发酵生产TTMP的能力，需要利用多种生物工程技术来提高微生物生产TTMP的能力，这些生物工程技术包括优良菌株的选育和诱变技术，以及优化培养基组成和培养条件的发酵工程技术。
利用多种生物工程技术提高TTMP产量，经过系统的研究后，Xiao等[21]经诱变筛选获得一株突变菌，用廉价的大豆胨和维生素代替蛋白胨和酵母粉，在5 L发酵罐中发酵，并在培养基中加入磷酸氢二铵（Diammonium phosphate，DAP），TTMP产量达到4.33 g/L。有机氮源的替换和DAP的加入使发酵生产TTMP的研究有了快速的发展。
2 合成机理研究1962年，Kosuge等[25]首次在枯草芽孢杆菌发酵液中检测到特殊香味物质，然后经过分离得到的晶体经分析其结构为甲基取代的含氮杂环化合物TTMP。Reineccius等[26]在可可豆的发酵物中检测到TTMP，进一步验证了微生物具有代谢产生TTMP的能力。从首次发现微生物能够发酵生产TTMP后，关于微生物中TTMP生成机制就一直是研究的焦点。
Kosuge等[27]提出生物发酵液中TTMP是由芽孢杆菌发酵产生的乙偶姻与氨基酸反应生成，但对于氮以何种形式与乙偶姻反应并未涉及。Besson等[23, 24]通过向Bacillus subtilis IFO 3013的发酵液中外源添加乙偶姻，经检测TTMP的生成速率和最终产量明显提高，提出乙偶姻是合成TTMP的重要前体。Adachi等[28, 29]通过向培养基中分别加入氨基酸（甘氨酸、谷氨酸、缬氨酸、精氨酸或天冬氨酸）和氯化铵作为唯一氮源，均可检测到TTMP的生成，作者提出发酵体系中TTMP是由发酵产生的乙偶姻与氨基酸的氨基部分形成，参与反应的可能是铵离子。Huang等[30]利用乙偶姻与醋酸铵反应模型体系，利用同位素标记的方法对中间体二氢吡嗪进行定性，提出TTMP是由乙偶姻和铵离子反应生成。目前普遍接受的TTMP合成机理是微生物通过糖类代谢产生乙偶姻后再与铵离子反应产生TTMP。
关于乙偶姻与铵离子的反应机制一直存在争议，争议的核心问题是发酵体系中微生物代谢产生的乙偶姻与铵离子反应生成TTMP过程是否为酶促反应。一些人认为此过程是酶促反应，但对与之相关的酶或基因并未有报道。另一观点是，TTMP生成过程是一种生物化学-化学（Biochem-chem）反应过程，即乙偶姻是在生物酶催化下合成的，但从乙偶姻到TTMP的生成是一种非酶催化的自发过程。Kim等[20]通过发酵和化学合成偶联方式实现乙偶姻与铵离子反应合成TTMP，验证了第二种观点[31]。吴建峰等[32]利用B. subtilis S12产TTMP原位反应验证乙偶姻与铵离子反应过程与生物酶无关。Xiao等[33]利用两步温控法，进一步验证乙偶姻与铵离子的反应为非酶催化的热力学自发过程。
以上研究证实生物发酵生产TTMP是由乙偶姻和铵离子反应产生的，因此发酵生产TTMP实际分为两个阶段：第一阶段是微生物发酵产生前体乙偶姻（图 1-The 1st step）；第二个阶段是乙偶姻与铵离子反应生成TTMP，该过程为自发的热力学过程（图 1-The 2nd step）。铵离子可经氨基酸降解产生[30]，也可直接来源于外源添加的无机铵盐[21, 32, 34]。
除主要产物TTMP外，可检测到一些副产物OXZ、2，3，5-三甲基吡嗪和2-乙基-3，5，6-三甲基吡嗪[21, 33, 36]。两步温控的反应过程显示，生成OXZ的反应可逆，随反应进行生成的OXZ又分解用来合成TTMP，而且此可逆反应受温度影响明显，当温度较高时，基本检测不到OXZ的生成[33]。根据发酵生产TTMP的反应机制，提高微生物发酵生产TTMP的方法有两种：一是获得优良菌株，提高前体乙偶姻的积累量；二是向发酵液中添加铵盐提高乙偶姻转化率和四甲基吡嗪的产率。
3 高产策略 3.1 提高发酵液中前体乙偶姻的量最早关于提高TTMP产量主要从发酵培养基优化和培养条件优化两方面进行。发酵培养基主要考虑碳源和氮源的优化，微生物对碳源的利用具有选择性，选择合适碳源能加快细胞生长与代谢产物合成。氮源对微生物的生长发育具有重要作用，它们主要用来合成细胞中的含氮物质。培养条件主要从pH、温度和溶氧量3个方面优化，pH是影响微生物生长的重要环境参数；温度不仅影响微生物的生长，而且对代谢过程中的关键酶活性也有重要影响，从而影响代谢产物的合成；溶氧量对细胞生长、代谢途径和产物的生成产生影响，溶氧量高有利于代谢产生更多乙偶姻，减少副产物乙醇、乳酸等的产生。
上述方法主要是通过影响生物本身生理代谢，提高乙偶姻的量来增加TTMP的产量。虽然可以提高发酵液中乙偶姻的量，但改变不明显。外源添加前体乙偶姻可以有效提高TTMP的产量[23, 24]，但乙偶姻价格较高，且高浓度的乙偶姻对细胞具有毒性，破坏细菌原有代谢平衡，而且外源添加的乙偶姻利用率不高[24]，因此筛选和诱变来获得内源性积累前体乙偶姻的菌种至关重要。
大部分TTMP合成菌株是一类产芽孢的杆菌属，受先前关于用芽孢杆菌进行吡嗪发酵研究报告的启发[23, 24]，Xiao等[21]采取生理富集的策略来筛选菌株，首先将菌悬液80℃热处理10 min，然后涂布进行初筛，最后诱变处理复筛获得TTMP高产菌株Bacillus sp. RX3-17，TTMP产量达到4.33 g/L。Zhu等[37]利用类似方法加热处理酒曲后筛选，从中筛得一株内源性积累前体乙偶姻的菌株B. subtilis XZ1124，其TTMP的产量达到4.08 g/L，再次证明热处理方法筛选产芽孢类TTMP高产菌株的有效性。
上述筛选内源前体乙偶姻积累菌株的策略是根据芽孢耐受高温的特性，热处理后再筛选可减少工作量。筛选得到的菌株前体乙偶姻是逐渐积累的，避免外源添加对细胞毒性较大的缺点。Xiao等[38]综述了提高发酵生产乙偶姻产量的策略，主要从菌种筛选，基因工程，培养基优化，发酵过程控制等方面论述提高乙偶姻产量的方法，对提高微生物合成TTMP产量具有重要指导意义。
3.2 增加铵离子来源TTMP分子结构中的氮来源于铵离子，因此提高发酵体系中铵离子的浓度有利于促进TTMP的合成。培养基中加入的有机氮源，在微生物发酵过程产生少量的铵离子，不能满足乙偶姻向TTMP转化时的需求，因此需要外源添加无机铵盐，例如硫酸铵、碳酸铵、硝酸铵、醋酸铵、草酸铵和磷酸铵等，可提高乙偶姻的利用率。不同的铵盐对产量的影响效果不同，研究表明当加入磷酸铵盐时，对TTMP生成速率和产量影响最大[21, 39, 40]。发酵培养基中加入过多铵盐对细胞生长和糖的利用不利，需要确定合适的铵盐加入量。利用铵盐的补加策略，在发酵合成乙偶姻的后期获得大量乙偶姻时，加入适量的铵盐可避免对细胞生长的抑制。
选择合适的铵盐有两层意义，一是满足细胞生长的需求以及与乙偶姻反应的需要，二是稳定和调节反应过程的pH。Huang[34]发现磷酸铵中的磷酸根在乙偶姻与铵离子反应形成席夫碱的过程作为质子供体和受体，而且过量的磷酸根可以维持反应液的pH稳定在中性，更有利于TTMP的形成。
3.3 分阶段控制策略虽然发酵过程添加乙偶姻和铵盐可以提高TTMP的产量，但两种物质的加入在一定程度上破坏微生物原有的代谢平衡，引起微生物数量的减少，从而引起乙偶姻积累量的降低，使TTMP的产量降低，而两阶段策略解决了上述矛盾。分阶段策略包括糖补加策略、铵盐补加策略、分阶段pH控制策略和两步温度控制策略。
乙偶姻是微生物的初级细胞代谢产物，生产TTMP菌株以糖为碳源，已知菌种主要以葡萄糖和蔗糖为碳源，因此提高培养基中糖浓度有利于乙偶姻的积累，然而细胞对糖的浓度有耐受范围，高浓度糖导致细胞生长环境渗透压增高，抑制细胞生长。糖浓度因素限制了更高浓度乙偶姻的获得，但分批量的加入糖，使细胞快速增值和代谢，积累前体乙偶姻，发酵后期积累一定量乙偶姻时补加无机铵盐，使乙偶姻快速转化为TTMP，提高乙偶姻的有效利用率和TTMP产量。Hao和Xu[41]和徐岩和朱朱峰[42]以枯草芽孢杆菌利用上述糖补加策略和铵盐补加策略：首先在培养基中分批添加葡萄糖使菌体能够发酵产生大量乙偶姻，在发酵液中加入磷酸铵盐，补充铵离子促进TTMP合成，经过补加策略乙偶姻的积累量和TTMP的产量分别提高了2.4倍和6.8倍。
研究发现，乙偶姻与铵离子反应生成TTMP过程在pH为中性时转化率和产量最高，而不同微生物其最适生长pH不同。如Bacillus subtilis CCTCC M208157菌株在pH5.5时生长最快，乙偶姻的生成速度快，积累量高。Zhu等[43]控制pH5.5时发酵获得最大乙偶姻积累量，再调节pH至7.0，实现乙偶姻向TTMP的快速转化，最终获得TTMP产量为7.43 g/L，产量提高22.2%[43]。利用两阶段pH控制策略，可明显提高前体乙偶姻的积累量和TTMP的产量。
上述策略虽提高TTMP产量，但因发酵后期菌体还有活性，不可避免的引起酶催化下乙偶姻的降解，且低温乙偶姻和铵离子的反应速率低，铵盐的加入影响乙偶姻的积累等导致TTMP产量变化较小。TTMP生物合成机制的研究显示从乙偶姻到TTMP的反应是自发的非酶催化反应，乙偶姻与铵离子的反应是在热动力学作用下进行的，因此升高温度可加快反应，缩短反应时间，增加TTMP产量。Xiao等[33]利用两步温度控制策略，以Bacillus subtilis CICC 10211菌株在37℃下发酵积累乙偶姻，当发酵29 h后，微生物开始消耗乙偶姻，此时停止发酵过程，向发酵液中加入磷酸氢二铵（按乙偶姻与铵离子比为1∶3），升高反应温度（65℃至95℃），反应温度95℃时，得到TTMP含量为8.34 g/L的发酵液，这是有报道芽孢杆菌发酵生产TTMP的最高水平，检测显示随温度升高反应速率和产量都增加，但温度提高容易引起TTMP的挥发和能量消耗。
3.4 添加氧化剂经过上述多种方法，TTMP产量得到大幅度提高，但乙偶姻与铵离子反应生成TTMP的产率低。导致产率低的原因可能是在TTMP的生成过程存在中间体2，3，5，6-四甲基-2，5-二氢吡嗪，需要氧化反应脱去两个氢才能生成TTMP。此过程可能为歧化反应，二氢吡嗪部分氧化为TTMP，另一部分转化为还原产物，但在此过程通入氧气并不能增加氧化产物的比例[31]。加入较强氧化剂，可能会增加TTMP的产量，因此在两步温控反应第二阶段，向发酵液中加入强氧化剂双氧水检测TTMP产量的变化，结果表明强氧化剂双氧水的加入可以明显增加产物TTMP的量。通过以上不同高产策略的实施，TTMP产量有所提高，不同菌株TTMP生产能力比较，见表 1。两步温度控制的发酵策略是目前最有效的提高TTMP产量的方法。
乙偶姻容易溶于水和有机溶剂的独特性质，使其下游过程很难找到一种高效的分离方法，相对于乙偶姻的分离提取，TTMP的纯化更简单，因此将发酵液中的乙偶姻转化为易分离的TTMP，不仅避免乙偶姻回收困难，而且增加了产品价值，这种方法称作FDR[38]（Fermentation-Derivatization-Recovery）。
TTMP溶解度对温度很敏感，当温度为37℃时，溶解度为4.77 g/L，当温度为4℃时，TTMP在水中的溶解度为1.06 g/L，低温时溶解度较小，因此从复杂的发酵液中分离得到TTMP的方法相对比较简单。直接将反应结束后的反应液降温析出晶体，过滤并用冰水洗涤即可得到纯度达到99%的TTMP。该方法得到的TTMP纯度高，但总的收率较低，主要是过滤洗涤晶体过程，滤出液中仍溶解有较多TTMP，这部分产品可再经蒸发、结晶、过滤等步骤回收。TTMP易挥发，反应液经蒸馏得到的馏分，利用冷冻干燥回收TTMP，可以获得更高的回收率，但处理方法复杂，需要大量能量，不适宜工业生产。
5 展望TTMP作为香味添加剂和医药中间体，需求量越来越大。目前，基于化石原料的化学合成法是TTMP工业生产的主要方法，面临资源短缺和环境污染问题，而随着微生物发酵生产TTMP研究的不断发展，天然TTMP产品产量会不断增加，产品更受消费者青睐，发展前景更广阔。
虽然经过众多研究人员不断研究，微生物发酵生产TTMP的产量有所提高，但还不适用于大规模工业化生产。限制性因素主要有微生物发酵产生的乙偶姻量少、乙偶姻向TTMP转化率低和TTMP回收率低，要克服这些瓶颈问题，主要从以下方面考虑。（1）提高菌株内源性乙偶姻积累量。菌株对乙偶姻的耐受性有限，不利于乙偶姻的积累，因此筛选内源性高产乙偶姻菌种，利用基因工程获得乙偶姻高产菌株来提高发酵产生的乙偶姻量是研究重点。（2）提高乙偶姻有效转化率。乙偶姻和铵根离子反应生成TTMP时最高产量也仅为理论产量的53%，需进一步探究转化率低的原因，提高乙偶姻有效利用率获得更高产量的TTMP。（3）提高回收率。已知TTMP分离提取方法回收率不高，造成产品浪费。微生物生产的主要弊端是发酵液成分复杂，产物不易分离纯化，因此优化培养基组成、开发高效率低成本的分离纯化方法是提高TTMP回收率，降低生产成本，促进TTMP大规模工业化生产前体。
目前微生物发酵生产TTMP，主要是以葡萄糖为碳源，因此开发能够利用其它糖（如木糖）为碳源的菌株，利用价值更高。
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