以往很多研究更为重视的是基因组中的编码序列，而约98%的非编码序列是随着对基因组及其功能的研究深入才逐渐引起人们的重视。小分子非编码RNA（Small non-coding RNAs，sncRNAs）是一类核苷酸长度在20-30 nt左右的非编码RNA（Non-coding RNA，ncRNA）^[1]，过去被认为是剪切加工的剩余产物，近年来的研究发现这一类小分子的生物学功能具有高度的组织特异性或发育阶段特异性，逐渐成为研究的热点。目前主要将ncRNAs分为3类，即piRNA（Piwi-interactingRNA，与piwi蛋白相互作用的RNA）、microRNA（miRNA，微小RNA）和si-RNA（小干扰RNA）^[1]。研究发现sncRNA参与生殖细胞转录水平、翻译水平上的调控，其中miRNA和piRNA通路是雄性不育动物模型研究中最重要的两条路径^{[2, 3, 4]}。一般情况下，miRNA调节精子形成是通过靶向结合在转录本的3' UTR区和下调细胞中特定的转录本来促进精子的发育，而piRNA则在生精过程中强烈抑制转座子元件的表达。本文综合分析了精子形成过程中相关sncRNAs的结构、功能、调控机制以及对动物雄性不育的影响，以期为进一步研究sncRNA的调控机制提供参考。

真核生物细胞内的RNA一般分为编码RNA和非编码RNA。目前发现，人类基因组中有2%的序列参与编码蛋白质，即翻译过程中产生的mRNA属于典型的可编码RNA，其余为非编码序列^[5]。sncRNAs是一类非编码RNAs，即属于不会编码蛋白质RNAs（ncRNA）的一部分。而ncRNA早在50年前就已被发现，1965年R. W. 霍利^[6]在面包酵母细胞中发现的丙氨酸tRNA和之后发现的rRNA都是非编码RNA；其中rRNA含量占总RNA的约82%，随着研究的发展，现在越来越多的新型ncRNA得以被发现，如核小RNA（snRNAs）、小RNA（miRNA）、与Piwi蛋白结合RNA（piRNA）、长链非编码（lnc-RNA）等。

ncRNA主要从转录来源、分子长度、功能等进行分类。从ncRNA转录来源分类，主要有内含子型和基因间型，前者由基因中的内含子序列转录而来，后者主要源于两基因间DNA序列的转录^[7]。ncRNA核苷酸片段同时也具有高度的大小特异性，其中分子长度多于200个核苷酸的通常被称作长链ncRNA，少于200个核苷酸的称为短链ncRNA^[8]。sncRNAs属于短链ncRNA，长度在20-30 nt左右。它主要包括小干扰RNA（siRNA）长度在21-23 nt，微小RNA（miRNA）长度在19-25 nt，生殖细胞含量丰富的与piwi（p-element induced wimpy testis）作用的RNA（piRNA）大部分在24-34 nt^[1]。

sncRNAs通常与高度守的Argonaute蛋白家族结合，该蛋白家族根据结构特异性可要分为两个亚家族：AGO和PIWI；两类亚家族分别具有两个特殊的结构域，即PAZ（Piwi-Argnonaute-zwille）域和PIWI（p-element induced wimpy testis）域^[3]。在体细胞和生殖细胞中，miRNA、siRNA一般与AGO蛋白家族结合；而piRNA与piwi蛋白结合并且高度富集在生殖细胞中。miRNA在哺乳动物细胞中的基本功能是负调节mRNA的翻译，但是通过Dicer敲除实验发现后代生殖细胞中miRNA的含量大幅减少^[3]；还有相关实验通过对猪性成熟前后睾丸组织差异表达miRNA鉴定及功能分析发现，miRNAs在动物睾丸发育成熟、生殖细胞的功能分化以及精子发生过程中发挥着重要的作用^[9]。Watanabe等^[10]研究发现病变的睾丸组织中发现piwi-RNA分子的初级加工产物受到影响而次级加工产物未受影响，同时发现piwi蛋白家族（MILI、MIWI2 和MIWI 3个成员）是成功形成精子所必需的一类蛋白家族，在精子形成过程中起到关键作用。miRNA和piRNA都在调节雄性生殖细胞分化过程中起到重要作用。

miRNA是一种约19-25 nt长度的高度保守的内源性非编码小分子RNA，在动物睾丸的发育成熟、生殖细胞的功能分化以及精子发生过程中发挥着重要作用^[11]。miRNA以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，主要由基因间隔区、内含子区转录而来^[9]。这一类sncRNA的表达具有组织特异性，但在不同生物体又表现出较高的同源性。

大量实验证据表明，miRNA可能是不同类型的组织细胞调控基因表达的重要元件，尤其是在睾丸组织中，现已发现对精子的发育起到至关重要的作用。大多数哺乳动物的mRNA都是miRNA的保守靶位，主要是通过与转录修饰后mRNA的3' UTR区结合来在抑制mRNA翻译，与mRNA的作用结合部分高达2-7个核苷酸；这类sncRNAs与编码蛋白的基因间有着较大的关联性，因为许多基因编码蛋白都会受到miRNA路径的调控^[12]。在miRNA的调控机制中其表达与相关因子呈现负相关，Björk等^[13]发现在睾丸组织中高富含miR-18，精子形成过程中它的表达与热休克因子2（HSF2）的表达呈现负相关，曲精小管中抑制miR-18的表达会导致HSF2蛋白水平增加、调控HSF2靶基因的表达。在精子形成过程中，许多组织如何利用miRNAs来控制基因的表达，miRNA通路中miRNAs的调控作用和靶位结合，目前这一系列的具体机制尚未明确；只是在圆形精细胞的拟染色体上发现了miRNA和miRNA相关蛋白，miRNA路径中其他组件蛋白在拟染色体外。

miRNA的编码序列在基因组中全部能够找到，但将近50%位于内含子区^[14]。miRNA的生成主要是由这部分序列编码的，形成初始miRNA（pri-miRNA）后经加工成为前体miRNA（pre-miRNA），最后剪切成为成熟的miRNA。pri-miRNA由miRNA相应的基因序列在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录形成的产物，此时在核内的pri-miRNA具有一个长的发卡茎环结构，发卡尾部还有两条单链；然后被双链RNA核酸内切酶Drosha切割形成pre-miRNA被转运到细胞质^{[5, 10, 16, 17]}，pre-miRNA此时的结构与pri-miRNA相比是丢失了发卡尾部的单链。细胞质中pre-miRNA的茎环区在内切核酸酶Dicer的作用下切除，形成成熟的miRNA，此时miRNA仍然具有前体的发卡样结构，只是失去了茎环。随后进入一个具有AGO蛋白的核糖蛋白复合体，这个复合体是miRNA诱导的沉默复合体（miRISC），在mRNA翻译中起到靶位锚定作用^[16]。mRNA被锁定与否主要根据AGO蛋白的类型和mRNA与miRNA的互补程度^{[16, 17]}。例如，哺乳动物AGO蛋白家族中的AGO2是唯一能裂解RNA的成员，它能在mRNA-miRNA高度互补配对的情况下与mRNA结合并使其降解^{[16, 17, 18]}。然而，与miRNA互补性较低或者完全不互补配对的mRNA被认为是封存在细胞质颗粒内或是翻译抑制。通过miRNA引起的翻译抑制机制已经被提出，miRNA能立即对mRNA的poly-A尾巴进行脱腺苷化，避免poly-A绑定蛋白结合而发生有效翻译^[19]。此外，AGO2绑定在修饰过的mRNA的5'端，与真核起始因子4E（eIF4E）竞争结合位点，从而阻止翻译起始^[20]，同时eIF6阻止功能型核糖体80s亚基的形成^[21]。另一方面，miRNA也能促进翻译的发生，但是仅限于细胞处于增殖状态或mRNA靶位的3' UTR富含腺嘌呤和鸟嘌呤核糖核苷酸。

在小鼠发育早期阶段，让小鼠条件性的失去Drosha或Dicer酶类，精子形成会被阻断，由此睾丸中miRNA功能机制的研究对精子发育十分重要。通过部分纯化的生殖细胞或是整个睾丸组织的表达模式研究发现，小鼠或人类的睾丸中都有其特有的miRNA类群^{[22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31]}，其中已发现部分参与哺乳动物精子的形成。

正如前面所提到的，sncRNA的生物学功能对精子的形成过程至关重要。piRNA是另一类内源性sncRNA，其核苷酸长度为24-30个左右，它的产生不依赖Dicer酶，而是与piwi蛋白作用^[30]。随着物种不断的进化，piRNA基因序列具有较低的保守性，但这类分子仍有活性，在果蝇中，piRNAs主要存在于胚胎、雌性和雄性生殖系中，编码piRNAs的基因主要位于基因组重复区域的转座元件中，piwi通路在精子形成过程中有沉默逆转录转座子的特定作用^{[31, 32]}。在哺乳动物中，区别于果蝇，piRNAs主要富集在雄性生殖系，且编码piRNAs基因序列主要存在于不含有转座子等重复序列的未注释的基因间区域内^[33]。然而，目前对于起源于转座元件外的piRNAs的功能仍然未知。有实验表明，转座子的控制与精子的发生有关，有利于保护遗传信息的稳定传递^{[34, 35, 36]}。缺乏piwi通路元件的动物模型表现为雄性不育，例如，敲除MIWI，MILI或MIWI2基因，都会造成小鼠精子产生明显缺陷，表现为雄性不育这也揭示了piRNA与精子形成的相关性^{[30, 37]}。

piRNA具有广泛的多样性，大约有上百万种类别，与仅有几百种的miRNA相比数目就显得庞大许多，这种多样性可能主要来源于对前体piRNA的剪切加工。在精子形成过程中，piRNA的序列大小与特异性变化很大，哺乳动物中主要将其分为两类：粗线前期piRNA与粗线期piRNA^{[5, 37]}。piRNA序列包含重复序列、来自基因间和基因区域的序列，由此大多数piRNAs定位于基因组的簇集位点，存在于遗传序列之间、遗传序列内部以及外部。粗线前期piRNA富含重复序列，主要与MIWI2和MILI两种蛋白结合；而粗线期piRNA大多是基因间DNA编码的序列，主要与MILI和MIWI蛋白结合，这一类分子通常出现在精母细胞的粗线期和圆形精细胞中^{[34, 38, 39, 40, 41]}。在刚出生几天小鼠的睾丸组织中主要发现的是粗线前期piRNA，在产后14.5 d小鼠体内发现，精细胞发育进入到第一次减数分裂的粗线期时，粗线期piRNA出现^[42]。有趣的是这些粗线期piRNA在成年小鼠piRNA总量中所占比例高于95%，转录因子A-MYB通过直接调控piRNA转录本和参与piRNA通路的蛋白组件的编码基因来促进起始粗线期piRNA的产生^[42]。

piRNA通路十分复杂，且目前尚未有明确定论。piRNA通路不同于miRNA路径，它不依赖Dicer酶活动。目前大多认为有两种通路，对初始piRNA进行初级加工，再通过“乒乓”扩增效应机制扩增piRNA且piwi蛋白具有酶切活性，由此来促进piRNA前体形成piRNA。在小鼠前精原细胞的粗线前期，piRNA是仅通过前体初级加工而成的产物，后续在初级精母细胞和次级精母细胞中“乒乓”效应机制是主要的生物途径^[43]。在初始加工中，piRNA前体是一条长的单链RNA，由piRNA基因簇转录而来，包括正义链和反义链；正义piRNA前体优先与MILI绑定活化转座子元件，反义前体piRNAs次级加工产物大多与MIWI2作用，能在转录水平通过DNA甲基化沉默转座子；其5'端与piwi蛋白家族成员相连，3' UTR被剪切产生特异的piRNA^{[32, 38, 43, 44]}。关于“乒乓”扩增机制，piwi蛋白（小鼠中的MILI）能识别初始piRNA前体，在其距离5'端10th的位置结合产生切割活性，形成次级piRNA前体^{[32, 44]}；在这个位置上次级piRNA前体被另一个piwi蛋白MIWI2识别结合并扩增，扩增出来的则是初始piRNA前体又再一次被MILI识别进入下一个扩增循环。MILI偏向于与初始piRNA前体结合，MIWI2则更易与次级piRNA前体结合，在“乒乓”机制中各司其职^[40]。通过“乒乓”循环同时产生的piRNA，转座子转录本由piRNA诱导的沉默复合体降解^{[44, 45]}，这个机制只有在初生小鼠的睾丸组织中能观察到，而成年小鼠中却没有，成年小鼠中MIWI2不表达，说明MILI和MIWI涉及piRNA的初始加工^[46]。

物种的起源和自我维护会依靠一种生殖隔离机制，即排斥与其他物种进行基因交流。其中一种生殖隔离机制的表现形式是雄性不育，许多自然杂交的后代可以存活，但是其雄性个体往往表现为完全不育或者部分不育。杂种雄性不育个体通常在两个水平上发育受到影响：一是性腺发育；二是精子形成。性腺发育受阻，不能发育成完整的睾丸因此表现为雄性不育，或是产生较小的睾丸进而有可能导致产生精子数量偏少。精子形成水平上一般存在两方面问题，一是生精过程受阻导致产生的精子数量不足或不产生精子；二是产生异常精子。sncRNA会调控精子的形成对雄性动物的生育能力产生影响。这方面的研究开始于睾丸组织切片、精子形态数量的观察研究，并逐步从组织形态观察过度到分子层面的研究，大量研究表明挖掘雄性不育的机理更有助于了解或解决雄性不育的问题。目前对精子形成过程中的sncRNA研究已初见成就，下面主要描述3种miRNA，即miR-122、miRNA-383、mir146，在雄性不育精子形成过程中的研究进展。

精子异常是雄性不育的主要因素，其发病机理仍不明确。MicroRNA在不育男性患者异常精子中的作用还未被研究清楚。Liu等^[46]用人类诱导多能干细胞探究miR-122在体外表达对精细胞分化的影响；在诱导以后，用miR-122突变体转染已形成细胞的精子，再用流式细胞仪分析细胞形精子的单倍体细胞群中DNA含量，miR-122突变体转染细胞的DNA含量明显比正常miR-122转染细胞的有所增加。诱导过程中，突变体miR-122转染细胞中的核转换蛋白2（TNP2）含量和鱼精蛋白的mRNA、蛋白水平含量都比正常miR-122转染细胞中的要高^[47]。对两组转染的细胞进行蛋白质分析，脂蛋白含量存在显著差异。研究表明miR-122与精子变形有关，miR-122可能通过抑制TNP2的表达来影响细胞形成精子，并抑制精子发育过程中蛋白质的表达。

最近研究发现miRNA-383的异常表达也与雄性不育有关。miRNA-383的表达在精子成熟性障碍不育男性的睾丸组织中相对下调，但其在精子形成过程中的作用机制和功能还不清楚。Tian等^[47]的研究发现，在小鼠睾丸组织中有88种miRNAs与X脆性智力低下蛋白（FMRP）有关，其中也包括miRNA-383。敲除Fmr1基因（X脆性智力低下蛋白基因）以后，睾丸畸胎瘤细胞（NT-2）中FMRP变低，miRNA-383对细胞增殖的抑制作用增强，FMRP与miRNA-383作用大幅度减少，影响miRNA-383与靶基因3'-UTR区的结合，比如，干扰素调节因子1（IRF1）和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）mRNA的3'-UTR区。另一方面，精原细胞和NT-2中miRNA-383的过度表达能下调FMRP的水平含量。miRNA-383直接与细胞周期蛋白D1结合，抑制其基因的下游效应元件，减少FMRP的表达。在FMRP下调表达的病人和敲除Fmr1基因的小鼠睾丸中都有发现，降低miRNA-383的表达，miRNA-383的下游基因表达异常。通常认为在精子形成过程中FMRP和miRNA-383之间可能存在一种反馈链，FMRP对miRNA-383的功能起负调控作用。FMRP通过与miRNA-383和它的靶位IRF1/ Cyclin D1结合来影响miRNA-383与其3'-UTR作用并调控miRNA-383的功能。

Huszar等^[48]发现mir146生物合成受阻会破坏精子形成从而导致雄性小鼠不育，此外还发现小鼠体内mir146高度调节精原细胞的分化，这个过程有赖于视黄酸信号。相对于分化的精原细胞，mir146在未分化的精原细胞中含量较高，mir146直接作用靶标是中间复合体1，mir146与中间复合体亚基1（一种类维生素A受体的辅助调节因子）的3' UTR区结合。mir146的表达水平会影响精原细胞转录本的水平，一般过分表达会减少精原细胞过程中的转录本水平，如在未分化的精原细胞中mir146过分表达会减少中间复合体1转录本和蛋白水平，反之，抑制mir146会影响精原细胞分化的相关基因表达上调，这样培养的细胞往往不能正常分化为精子，可能导致细胞凋亡。体外暴露在视黄酸下的雄性生殖细胞会诱导精原细胞的分化及后来精母细胞的减数分裂。研究发现暴露在视黄酸条件下的精原细胞mir146会被下调，精原细胞在转录水平上响应视黄酸诱导而促进分化，生殖细胞成分中已分化精细胞趋于含量更低，由此看来在分化过程中依靠视黄酸信号来调节精细胞的分化过程。

国内对动物sncRNA方面的研究亦随着小分子RNA研究的兴起而逐渐被重视，有研究者利用动物模型对sncRNA在精原干细胞分化过程中的作用或生殖干细胞中的表达做了一定的研究。例如，在miR-34家族中的miR-34c，在细胞内的多个过程中都有作用，对精子发生过程也有重要的调控作用。Nanos是一类进化保守的RNA结合蛋白，在生殖细胞（包括原始生殖细胞和生殖干细胞）发育中发挥功能。在小鼠中，Nanos2在精原干细胞中表达，在精子发生过程中具有维持干细胞多能性的作用。于萌等^[49]以miR-34c作为研究对象，预测发现Nanos2是miR-34c的靶基因之一，构建其双荧光素酶报告基因载体及双荧光素酶报告基因突变载体验证靶基因，通过在分离的原代及传代精原干细胞中转染合成的miRNA模拟物、抑制物，及使用含有miR-34c慢病毒颗粒转导小鼠的曲细精管，检测、分析生殖细胞分化特异性标志基因的变化，深入研究了miR-34c对生殖细胞分化特异性标志基因的调控作用，研究结果证实miR-34c可能会通过靶向Nanos2以促进精原干细胞的分化。徐璐等^[50]以原始生殖细胞和精原干细胞为细胞模型，利用Real-time qPCR技术检测了Piwil1基因在如皋黄鸡生殖系干细胞中的相对表达量。结果表明，Piwil1基因在生殖系细胞中特异性表达，且Piwil1基因在精原干细胞中的表达量显著高于原始生殖细胞，这表明Piwil1基因可能在精原干细胞的“DNA重新甲基化”以及自我更新过程中发挥重要作用。

精子的形成过程是雄性不育研究的重点，但是目前都还处于起步阶段，很多机理及作用机制还未研究清楚，也许将来这方面会成为sncRNA的研究热点，同时也对雄性问题不育研究提供参考，有望解决动物遗传育种方面的雄性不育问题。

杂种雄性不育在物种间是一种普遍的生殖隔离现象，然而很少知道导致这种不育现象的发生原因，尤其是在自然杂交的物种中。为探究雄性不育的原因，Lisa等^[51]以蟾蜍为研究对象，使美国西南部地方的平地蟾蜍和墨西哥蟾蜍杂交得到杂交后代发现，杂种后代可以存活，但雄性杂交后代生育能力降低。比较杂交后代和正常蟾蜍的睾丸大小和不同发育阶段生殖细胞的形成状态发现，杂交雄性后代的睾丸大小与纯种的不同，杂交个体中睾丸大小变异范围比较大。精细胞形成早期阶段数目与纯种相似，但是成熟精子的形成明显少于纯种的。渗入过其他物种基因的个体产生的精细胞要么异常畸形要么不具游动性。这些结果表明，杂种的不相容性在精子的后期发育中也是种间繁殖的屏障。类似的试验在国内也曾做过，余劲聪等^[52]在牦牛和杂交后代犏牛上做过组织形态学、精子发生过程研究。犏牛，即牦牛和普通黄牛的杂种。牦牛主要分布于以青藏高原为中心及其毗邻的高山、亚高山地区的特有牛种，对高寒草地的生态环境有极强的适应性，在空气稀薄、牧草生长期短、寒冷和枯草期长的恶劣环境下生活自如，繁衍后代，为当地牧民提供奶、肉、毛、役力及燃料等生产、生活必需品，是当地不可或缺的畜牧业经济^[53]。但是繁殖能力在2年一胎或3年一胎的水平，无法满足当地牧民的需求，于是想通过牦牛与普通牛杂交得到较高繁殖力、较高产奶量等经济价值较高的杂种牛即犏牛。杂交代（犏牛）产奶量高，但雄性不育，而母犏牛无论与普通牛回交还是与牦牛回交，生产的后代生产性能都低下。若能解决犏牛的雄性不育问题则有助于提高当地畜牧业经济，从而能解决犏牛这种较高经济性状的繁殖问题以满足人类所需。

目前关于miRNA通过对关键基因的转录后水平调控来介导精子生成的遗传机制的报道较少，有关动物miRNAs基因功能以及与动物繁殖性状相关的miRNAs也鲜有研究。Chen等^[54]在对水稻细胞质雄性不育系研究中，设计了一个转基因的方法来改善植物的高度和雄性不育系杂交水稻圆锥花序的延伸和培养杂交半矮秆植物。使用方法包括两个部分：人工microRNA（amiRNA）和人工靶序列模拟，可以篡改内源性Eui1基因（与水稻节间伸长有关）的差异表达。amiRNA是近年来发展起来具有较高特异性基因沉默的方法，而人工靶序列模拟具有天然抑制miRNA功能机制的特点，是最近发展起来的一种方法。这种方法提供了一个范例，通过与amiRNA结合和人工靶序列模拟技术，调节内源基因的表达和实现所需的表型。

综上所述，有望通过对犏牛和普通牛睾丸组织的sncRNAs的深入研究解决犏牛的雄性不育问题，可对精子形成过程中研究比较多的miRNA、piRNA及其靶位进行人工干预。随着研究的不断展开和深入，对于miRNA在精子形成中的作用及其机制的阐明，以及利用多种分析预测手段研究miRNA与精子形成中各调控蛋白组成的关系，将会使人们对高等真核生物基因表达调控的网络理解提高到一个新的水平，对miRNA作用机制的研究可以为解决雄性不育问题奠定理论基础，也可为未来采用小分子干预生殖调节、治疗生殖相关疾病以及动物育种方面的问题提供新策略。