2.中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所，北京 100166；
3.中国科学院北京基因组研究所，北京 100101
2. Institute for Drug and Instrument Control，Health Department，the General Logistics Department of People’s Liberation Army，Beijing 100166；
3. Beijing Institute of Genomics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101
现阶段最常用的三大基因编辑技术主要有锌指核酸酶技术（Zinc finger nucleases，ZFNs）、转录激活样效应子核酸酶技术（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）、CRISPR/Cas9技术（Clustered regularly interspaced short palindromic Repeats/Cas9 nuclease）[1]。其中TALENs技术具有无上下文效应[2]、脱靶效率低于ZFNs技术和CRISPR/Cas9技术[3]、特异性高等优点，现已成为一种广泛应用的基因定点修饰技术。
TALENs由转录激活样效应子蛋白（Transcription activator-like effector，TALE）、识别域和FokIⅡ核酸酶及切割域组成[4]。其中，TALE蛋白源自黄单胞杆菌，一般由N端、C端和中央串联重复模块组成，N端包含Ⅲ型转运信号（Translocation signal）；C端包含核定位信号（Nuclear localization signal，NLS）和酸性转录激活域（Activation domain，AD）；中央重复模块具有“一模块识别一碱基”的特点，且没有上下文效应，其结构高度保守，一般由34个氨基酸组成，仅在12和13位高度可变，又称这两位的氨基酸为RVD（Repeat-variable diresidue）[2, 5, 6]。本研究采用并改造TALENs的精简处理的骨架，即N端包含136个氨基酸，C端包含63个氨基酸，且C端融合有FokIⅡ型核酸内切酶[7, 8, 9, 10]。利用TALENs这些结构特点可以构建识别任何DNA序列的TALENs，包括核基因组和线粒体基因组[11, 12]。
在TALENs应用中，TALENs的中央重复模块的组装是限速步骤，目前为止，最常用的TALENs构建方法大体可分为Golden Gate法[13, 14, 15, 16]、FLASH（Fast Ligation-based automatable solid-phase high-throughput）法[17, 18]、模块组装法（unit assembly，UA）法[7]及其他方法，如LIC法（Ligation-independent cloning）[19]、ICA法（Iterative capped assembly）[20]、idTALE法[21]、REAL法（Restriction enzyme and ligation）[22]等。其中Golden Gate法、FLASH法最为省时，然而这两种方法存在的酶切连接效率问题或因PCR技术的限制性而出现非特异的问题难以避免，相比之下，UA法虽构建时间较长，但TALENs编码序列可控且没有上述问题，同时可以根据密码子简并原则改变TALEs编码序列，降低TALENs重复模块编码序列的重复性，降低mRNA的重复性，有助于提高TALENs在真核细胞内表达效率。本研究提供了TALENs的一单元模块编码序列库，并改造表达载体pCS2-peas/perr，利用UA法定向组装TALENs。鉴于目前没有报告清晰的介绍线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）双链断裂（Double-strand breaks，DSB）的修复机制，本研究将mtDNA靶序列随机整合于核染色体中，利用核基因组的同源重组（Homologous recombination，HR）和非同源末端连接（Non-homologous DNA end joining，NHEJ）修复方式[23]，以检测新型模块组装法构建的TALENs活性，旨在为编辑mtDNA提供新方法。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞HEK293F细胞为本实验室保存。
1.1.2 试剂和引物Xba I、Nhe I、AsiS I、Sac I、BamH I等限制性核酸内切酶购自NEB公司；质粒小提试剂盒购自北京庄盟国际生物公司；高纯度小提中量试剂盒购自天根生物科技公司；HA、Flag、β-actin抗体购自Sigma公司；Anti-Rabbit、Anti-mouse抗体购自CST公司；转染试剂X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent购自Roche公司；DMEM高糖培养基购自Invitrogen公司；胎牛血清购自Biowest公司；pUC19、pEGFP-N1质粒由本实验室保存；pCS2-peas/perr质粒购自康为世纪公司；所有引物序列（表 1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；测序由华大基因公司完成。
HEK293F细胞以及HEK293F-T1细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养于37℃、5%CO2温箱中。
1.2.2 pCS2-peas/perr载体骨架的改造本研究于载体0.5单元的RVD编码序列两侧分别构建AsiS I和Xba I酶切位点，如图 1所示。实验方法如下：以pCS2-peas/perr载体质粒为模板，TALEN0.5_N-F/R为引物对，扩增得到全长质粒对，PCR产物经DpnI酶切，转化后挑单克隆菌落，pCS2-NF/CR引物对测序鉴定出阳性质粒，最终得到载体质粒pCS2-0.5U-peas/perr。
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| A：pCS2-peas/perr载体骨架改造示意图；B：改造后0.5U序列及酶切位点详图 图 1 pCS2-0.5U-peas/perr构建示意图 |
基于TALEs自然单元模块序列[6]和UA法的人工单元模块序列[7]，本研究设计的人工单元模块序列命名为偏单元（图 2），起始于TALEs自然模块的+19位氨基酸残基Leu，终止于下一个自然模块的+18位氨基酸残基Ala。于偏单元序列的两端分别构建Xba I、Nhe I同尾酶识别位点，于RVD区附近构建AsiS I酶切位点。根据AsiS I酶切位点的有无分为活动一单元模块（含AsiS I酶切位点）和固定一单元模块（不含AsiS I酶切位点）。活动一单元模块位于TALEs重复模块的首位，并命名为0序列，依次标记为A0、C0、G0、T0。固定一单元模块位于第2位及后续位置。由于氨基酸密码简并性和第4位、32位氨基酸残基的高度可变，TALEN模板序列数目模大，经排列组合计算后结果如表 2所示。选取了氨基酸序列一致的4种基本骨架a1、c1、g1、t1，碱基序列不同但差异率并非最大（折中差异性），N-LETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQA-C（灰色背景部分为RVD区）。依次构建含有4种RVD（NI、HD、NN、NG）的一单元模块，依次标记为A1、A2、A3、A4，C1、C2、C3、C4，G1、G2、G3、G4，T1、T2、T3、T4，如表 3所示。
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| A：横线部分为TALEs自然单元重复模块序列，横线外部分为末位0.5单元模块；B：UA法人工单元重复序列；C：本课题组人工单元重复序列 图 2 TALEs偏单元的氨基酸序列示意图 |
活动单元的构建以C0序列为例，构建方法如下：以C0的DNA编码序列（表 3）为模板分别合成Oligo片段C0-L1、C0-L2和C0-S1、C0-S2（表 4），C0-L1/C0-L2、C0-S1/C0-S2分别退火，得到片段C0-L、C0-S，对pUC19质粒进行BamH I/Sac I双酶切，将片段C0-S连入，再次进行Xba I/AsiS I双酶切，将片段C0-L连入，得到包含C0序列的pUC19-C0质粒（图 3）。合成A0-S1/A0-S2、G0-S1/G0-S2（NN）、T0-S1/T0-S2（序列见表 4），两两退火后，分别连入AsiS I/Nhe I双酶切后的pUC19-C0偏单元载体，得到分别包含A0、G0和T0序列的质粒pUC19-A0、pUC19-G0、pUC19-T0。从合成方法来看，A0、C0、T0和G0序列除了RVD区编码序列不同外，其他位置编码序列均相同。
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| 图 3 TALEs偏单元重复模块的碱基序列设计示意图 |
固定单元的构建以A1为例，构建方法如下：根据A1的DNA编码序列（表 3），合成Oligo片段A1-L1、A1-L2和A1-S1、A1-S2（表 5），分别退火，得到片段A1-L、A1-S。以A1-L1和A1-S2为引物，A1-L、A1-S为模板，扩增得到A1。以A1为骨架，RVD区分别换为其他3种RVD（HD、NN和NG）的编码序列，可得到C2、G2和T2。其他模块构建方法为，将A1-S2的RVD去分别改为其他3种RVD（HD、NN和NG）的编码序列，命名为C2-ar、G2-ar和T2-ar（表 5），分别和A1-L1组成引物对，以A1为模板，扩增得到C2、G2和T2。最终得到A1、C1、G1、T1，A2、C2、G2、T2，A3、C3、G3、T3，A4、C4、G4、T4。
在NCBI查询得到人线粒体DNA序列（NC_012920.1），利用TALE-NT 2.0（TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0）设计一系列TALENs靶序列。经过靶位点比对和筛选，本研究选取选择线粒体DNA（NC_012920.1）的16347-16387位为靶序列，5'-TCAAATCCCTTCTCGTCCCCATGGATGACCCCCCTCAGA TA-3'，并依据该靶序列设计TALEs的串联重复模块。本研究设计选取12.5个TALEs模块，Left-arm：5' -CAAATCCCTTCTC-3'；Right-Arm：5'-ATCTGAGGGGGGT-3'。
用Nhe I/Sac I和Xba I/sac I分别对模块载体和目的模块序列进行酶切、连接，依次由一单元得到二单元，得到四单元，再根据设计序列进行灵活连接[7]。本研究组构建的三单元模块库，分别由4个三单元模块两两相连，得到2个六单元模块，再次相连后与活动一单元连接，最后得到13单元TALE-13U，Left-arm的构建如图 4所示，然后将其进行AsiS I和Nhe I（Xba I的同尾酶）双酶切，连接入pCS2-0.5U-peas/perr载体，得到pCS2-12.5U-L/R质粒对。
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| 图 4 TALE-13U构建示意图 |
合成5'端和3'端分别含有Nhe I、Age I酶切位点的靶序列片段，分别对靶序列片段和pEGFP-N1质粒进行Nhe I/Age I双酶切后，将二者进行连接、转化，挑取单克隆菌落，经PCR检测，测序验证含有靶序列的目标质粒，转染培养于35 mm dish的HEK293F细胞，24 h后消化转移至10 cm dish培养，同时加G418筛选，在推荐药物浓度附近设置浓度梯度，经摸索得到G418的最适浓度为1 mg/mL。挑取单克隆细胞系，继续培养，经PCR扩增并测序，得到整合有靶序列的目标细胞系，标记为HEK293F-T1。
1.2.6 TALENs在细胞内表达活性的检测将HEK293F-T1细胞接种于两个10 cm dish中，待两盘细胞长至生长对数期且细胞密度一致（约24 h），选取其中一盘细胞瞬时转染1.2.4中构建的质粒对pCS2-12.5U-L/R，另一盘作为control，再继续培养48 h，收细胞，提取基因组，PCR扩增后测序鉴定打靶效果。PCR反应为活性检测的关键步骤，反应体系为：基因组（模板）200 ng，上/下游引物各0.5 μL，LA Taq 0.5 μL，10×LA PCR BufferⅡ 2.5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL，ddH2O补足至25 μL。反应程序：95℃ 2 min；95℃ 15 s、60℃ 30 s，72℃ 1 min（35个循环）；72℃ 5 min。
2 结果 2.1 靶序列的确定 2.1.1 HEK293F细胞线粒体中靶序列的确定依据线粒体DNA（NC_012920.1），在靶序列附近设计引物，以提取的HEK293F基因组为模板，扩增含有靶序列的片段并测序，测序结果峰图如图 5所示。
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| 图 5 mtDNA中靶序列测序峰图 |
提取HEK293F-T1细胞基因组并作为模板，在pEGFP-N1-T1质粒靶序列两侧设计引物，扩增靶序列，测序结果峰图 6如图所示。
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| 图 6 HEK293F-T1基因组中靶序列测序峰图 |
模块组装法组装TALENs，构建得到pCS2-12.5U-L/R质粒，经AsiS I/BamH I酶切鉴定，片段为1 448 bp，大小如图 7-A所示，测序结果经Blast比对，左右臂的氨基酸比对结果如图 7-B所示。
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| 图 7 pCS2-12.5U-L/R质粒酶切（A）及pCS2-12.5U-L质粒测序比对（B）结果 |
通过提取瞬时转染pCS2-12.5U-L/R质粒的HEK293F-T1基因组，扩增、测序分析后，观察到靶序列强峰下出现套峰，结果（图 8）表明，TALENs成功的作用于HEK293F-T1基因组上的靶序列，造成双链断裂后，在细胞核内进行了修复。
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| 图 8 pCS2-12.5U-L/R打靶结果图 |
TALENs识别域是由n个串联的高度重复的模块组成，在细胞转录与翻译过程中，能否对高度重复的序列十分准确的转录翻译成重复的蛋白模块，至今还未有研究组论证，本研究组尝试着尽量降低TALENs编码序列的重复性，而模块组装法恰好能够保证构建的TALENs编码序列的高保真性[24]，使得TALENs编码序列重复性可控，提高了TALENs的表达效率。
3.2 针对mtDNA的相关编辑研究因mtDNA的碱基序列长度远远小于nDNA（Nuclear DNA），且线粒体中针对双链断裂的修复机制尚未准确解析。本研究组中将mtDNA序列整合于核基因组中，利用核基因组中的HR和NHEJ机制对其进行修复，同时考虑到TALENs中央重复模块的数目是否会影响打靶效率，本研究中设计的TALENs均选取12.5个重复模块，对nDNA打靶效果比较理想，进而为mtDNA的编辑研究奠定了基础。Bacman[12]实验组首次利用TALENs编辑mtDNA的相关研究，为本实验室提供了可参考的思路与方法，本实验组下一步将进行mtTALENs（Mitochondria-targeted TALENs）的研究。
4 结论本研究中提供的新型模块组装法可定向的组装TALENs，提高克隆效率，并增加了靶位点设计的灵活性，在表达强度和打靶效果上均可达到理想效果。
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