深海是全球最大的独立生态系统，生活于深海的海洋微生物处于独特的物理、化学和生态环境中，形成了特殊的遗传机制和代谢系统，使深海微生物能产生结构新颖、活性独特的次级代谢产物。因此，深海微生物具有重要的研究和应用价值，可为开发新的生物活性物质提供优异的种质资源^{[1, 2, 3]}。海洋真菌是海洋微生物的重要组成部分，具有巨大的开发潜力^[4]。为了发掘深海真菌活性次级代谢产物，本课题组前期对分离自南海沉积物的深海真菌进行培养条件优化、活性筛选和化学筛选，发现菌株FS86具有生长速度快、代谢产物丰富、抗真菌活性强等特点。本研究以该菌株为研究对象，根据其培养特征和形态特征及ITS序列分析对该菌株进行鉴定，并测试其发酵提取物对病原真菌和肿瘤细胞株的抑制活性，旨在为进一步开发新的抗菌、抗肿瘤活性物质提供依据。

菌株FS86分离自南海（12° 58.551' E，17° 0.646' N）1598 m深处的海洋沉积物。

病原真菌：白色念珠菌（Candida albicans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、绿色木霉（Trichoderma viride）、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、柱枝双孢霉（Cylindrocladium scoparium）、新月弯孢菌（Curvularia lunata）、链格孢（Alternaria alternata）。肿瘤细胞株：人肺癌细胞株NCI-H460、人乳腺癌细胞株MCF-7、人神经胶质瘤细胞株SF-268、人肝癌细胞株HepG-2。以上菌株和肿瘤细胞株均保存于广东省微生物研究所。

分离培养基：含3%粗海盐的PDA培养基；液体发酵培养基：马铃薯200 g、葡萄糖10 g、甘露醇20 g、酵母膏3 g、蛋白胨5 g、味精5 g、粗海盐3 g，水1 L。病原真菌采用PDA培养基；肿瘤细胞株采用RPMI-1640培养基。

二甲基亚砜（DMSO），Sulforhodamine B sodium salt（SRB），均购自Sigma公司；三氯醋酸（分析纯），广州化学试剂一厂；RPMI-1640培养基，吉诺生物医药技术有限公司。

PYX-DHS电热恒温培养箱，湖北省黄石医疗器械厂；YXQ.WY21-600电热高压蒸汽灭菌锅，广州市华南医疗器械有限公司；超净工作台，上海恒益科技有限公司；RE-2000旋转真空蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；2123-2二氧化碳培养箱，Shellab公司；DMI3000B倒置显微镜，Leica公司；MULTISKAN GO全波长酶标仪，Thermo公司。

无菌操作取适量海洋沉积物样品用含3%粗海盐的无菌水稀释到10%，28℃振荡20 min，取0.1 mL均匀涂布在分离培养基中，28℃恒温箱培养，待菌落长出后，挑取平板中单一菌落转接至含有新鲜分离培养基的培养皿中，继续培养，经多次分离纯化直至获得纯菌株后，转接至斜面培养3-5 d 后保存于4℃冰箱。

将菌株FS86接种于PDA培养基平板上，28℃下培养7 d，肉眼观察菌株的培养特征；利用光学显微镜和电子显微镜观察其菌丝、分生孢子梗、分生孢子等形态特征。

采用真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，作为PCR扩增的模板。PCR扩增采用真菌rDNA内转录间隔区（rDNA ITS）通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，正向）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，反向）扩增分离菌株的rDNA ITS区。PCR采用20 μL 反应体系，通过Ex Taq（TaKaRa）进行。反应条件：93℃预变性3 min；93℃变性45 s，55℃复性45 s，72℃延伸1.5 min，共30个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物由上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。获得的序列通过BLAST程序在GenBank上进行相似性序列检索，下载相关序列，以Cercospora beticola CBS 124.31（KF251298）为外类群，运用MEGA 5软件通过邻接法（Neighbor-Joining），构建系统发育树，Bootstrap 设置为1 000次重复。

将菌株FS86接种到液体发酵培养基中，28℃，120 r/min 培养7 d后将发酵产物用乙酸乙酯冷浸提取多次至提取液基本无色，合并提取液，经55℃下减压浓缩至干，得发酵提取物。将提取物浸膏用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配制成50 mg/mL浓度，备用。

取对数生长期的白色念珠菌用生理盐水稀释至浓度为10⁶ CFU/mL的菌液；其它真菌调整至孢子数为10⁶ 个/mL的孢子悬液，吸取制备好的菌液或孢子悬浮液1 mL于培养皿中，倒入已冷却至合适温度的PDA培养基，混合均匀，用无菌镊子夹取厚度为1.5 mm、直径为6 mm的滤纸片置于含菌平板上，在滤纸片上分别滴加提取液5 μL作为样品组，以DMSO代替发酵提取液作为空白对照组，以制霉菌素作为阳性对照，将平板置于28℃恒温箱培养72 h，用十字测量法测量抑菌圈直径的大小。

将提取物溶液用DMSO分别稀释至浓度为4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05 mg/mL。按1.2.4方法测定，观察滤纸片周围的抑菌圈，以周围有抑菌圈的滤纸片所含样品的最低溶液浓度为最低抑菌浓度（MIC值）。

采用SRB法^[5]测定提取物对肿瘤细胞毒活性：取对数生长期的NCI-H460、SF-268、MCF-7、HepG-2细胞，用胰酶消化，台盼蓝染色计数，台盼蓝排斥实验检测细胞活力大于95%后，用新鲜培养基调整细胞浓度为3 × 10⁴个/mL，细胞接种于96孔板，每孔加入180 μL的细胞悬液，并设空白孔调零，于37℃、5% CO₂ 培养箱培养24 h。待细胞贴壁后，每孔加入20 μL待测样品，阴性对照加20 μL培养基，以顺铂作阳性对照。置CO₂培养箱中培养72 h后，加入50 μL 50%冷三氯醋酸固定细胞，4℃放置1 h 后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后每孔加入由1%冰醋酸配制的浓度为4 mg/mL的SRB溶液100 μL，室温中染色30 min，去上清，用1%冰醋酸洗涤5次，空气干燥。最后每孔加入浓度为10 mmol/mL的Tris 溶液200 μL，用酶标仪测定570 nm处的吸光度（A）值，按以下公式计算提取物对细胞生长的抑制率，采用SigmaPlot 10.0 软件计算IC₅₀值。

细胞生长抑制率（％）=（1-A_{样品组/药物组}/A_阴性组）×100％。

菌株FS86在PDA培养基上28℃培养7 d，直径达35 mm，菌落正面橄榄褐色，有辐射状沟纹，中央稍隆起，边缘白色，绒毛状；菌落背面灰黑色。菌丝有隔，粗3-5 µm，分生孢子梗直立或稍弯曲，分枝或不分枝，圆柱形，（60-165）µm×（3-5）µm，具分隔；枝孢圆柱形或纺锤形，（7-21）µm×（3-3.5）µm，具1-4个分隔；分生孢子黄褐色至橄榄褐色，球形、近球形或卵圆形，（3.5-6.3）µm×（3.1-4.2）µm，单孢，表面具疣突，孢脐明显（图 1）。参照Bensch等^[6]的分类系统，菌株FS86鉴定为球孢枝孢（Cladosporium sphaerospermum）。

A和B：分别为菌株FS86在PDA培养基上正、背面的培养特征；C和D：扫描电镜下菌株FS86的微观特征 图 1 菌株FS86的培养特征及扫描电镜下的形态特征

图选项

将测序获得的序列信息提交至GenBank，登录号为KF294264。BL-AST结果显示，菌株FS86与C. sphaerospermum AT-CC MYA-4645（HQ263345）的相似度为99.4％。从构建的系统发育树（图 2）看，菌株FS86与4条C. sphaerospermum序列聚为高度自展支持的一支，彼此间遗传距离极小。因此，通过分子系统学分析确定菌株FS86为球孢枝孢。

图 2 菌株FS86与相关菌株的系统发育树

图选项

从表 1和图 3可以看出，菌株FS86的发酵提取物对8种病原真菌都具有明显的抑制作用，抑菌圈直径均达30 mm以上；其中对白色念珠菌的抑制作用最为显著，抑菌圈直径达45.2 mm，对黑曲霉和黄曲霉的抑菌圈直径为40 mm左右，对其他病原真菌的抑菌圈直径为30-37 mm。

表 1 菌株FS86发酵提取物对病原真菌的抑制作用（x±s，n=3）

表选项

A：白色念珠菌；B：黑曲霉；C：黄曲霉；D：绿色木霉；E：柱枝双胞霉；F：胶孢炭疽菌；G：新月弯孢霉；H：链格孢 图 3 菌株FS86对病原真菌的抑制效果

图选项

通过菌株FS86的发酵提取物对8种供试真菌最低抑制浓度的测试，结果（表 2）显示该提取物对白色念珠菌和新月弯孢霉的最低抑制浓度（MIC值）仅为0.1和0.25 mg/mL，对其他真菌的最低抑制浓度为1-4 mg/mL。

表 2 菌株FS86提取物对病原真菌的最低抑制浓度（MIC值）（n=3）

表选项

菌株FS86发酵提取物的细胞毒活性测试结果（表 3）显示，该提取物对4种肿瘤细胞株SF-268、MCF-7、NCI-H460、HepG-2均表现出很强的细胞毒活性，其中对MCF-7的抑制效果优于阳性对照药物顺铂，IC₅₀值仅为0.86 μg/mL，对其它细胞株的IC₅₀值均接近阳性对照药物，IC₅₀值为1.42-2.13 μg/mL。

表 3 菌株FS86发酵提取物对肿瘤细胞株的IC₅₀值（x±s，n=3）

表选项

枝孢属（Cladosporium）真菌种类繁多，分布广泛^[4]。研究表明，枝孢属真菌的代谢产物具有多种生物活性，是寻找活性物质的重要资源。如分离自芽枝状枝孢（C. cladosporioides）的枝孢菌素（Cladosporin）对红蜘蛛、蚜虫和纷壳虫等害虫有较强的毒杀作用^{[7, 8]}；来源于植物的芽枝状枝孢还能产生石杉碱甲、紫杉醇等活性物质^{[9, 10]}；分离自栓皮栎的枝孢菌（C. sp. I（R）9-2）能产生抗真菌活性的布雷菲尔德菌素（Brefeldin A）^[11]，该细胞毒素还具有抗肿瘤、抗病毒、抗有丝分裂等活性^[12]；从银杏中分离的尖孢枝孢（C. oxysporum R2）其发酵粗提物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有明显的抑制作用^[13]。目前，关于海洋来源的枝孢属真菌活性代谢产物的报道还不多，Shigemori等^[14]从分离自海藻的枝孢菌（C. sp. L037）中分离得到12元大环内酯sporiolides A，它对新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）和粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）具有抑菌活性；林涛等^[15]从分离自海口红树林泥土的球孢枝孢（C. sphaerospermum PJX-41）中分离得到2个具有抗肿瘤活性的喹唑啉酮生物碱类化合物lapatin A和tryptoquivaline；Wu等^[16]从太平洋深海来源的球孢枝孢（C. sphaerospermum 2005-01-E3）中发现化合物Cladosin C对流感病毒A H1N1具有抑制活性。本研究发现来源于南海深海沉积物的球孢枝孢（C. sphaerospermum FS86）发酵提取物具有明显的抗真菌和细胞毒活性，因此该菌株具有重要的研究价值，其活性代谢产物有待进一步深入研究，以期开发出新型的抗真菌和抗肿瘤活性物质。

本研究通过形态学和ITS系统发育分析，将深海真菌FS86鉴定为球孢枝孢（C. sphaerospermum）。经抗菌活性测试发现，该菌株的发酵提取物对所有的供试真菌均有明显的抑制作用，抑菌圈直径均达30 mm以上，其中对白色念珠菌的抑制活性尤其显著，其最低抑制浓度（MIC值）为0.1 mg/mL；经细胞毒活性测试发现，该菌株的发酵提取物对供试的4种肿瘤细胞有显著的抑制活性，其中对细胞株MCF-7的活性尤为显著，其IC₅₀值为0.86 μmol/L，低于阳性对照药物顺铂。