2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 甘肃省牦牛繁育工程重点实验室，兰州 730050
2. Key Laboratory of Yak Breeding Engineering of Gansu Province，Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730050
牦牛是分布于海拔2 000 m以上，以我国青藏高原为中心及其毗邻的高山亚高山地区的牛种之一，为牧民提供奶、肉、毛、役力、染料等生产和生活必需品[1]。牦牛肉属于半野生天然绿色食品，富含蛋白质、氨基酸、铁元素以及胡萝卜素、钙等微量元素，脂肪含量低，但牦牛肉的嫩度制约着其市场的接受度，因此，影响牦牛肉嫩度的候选基因成为当今研究的热点之一。
钙蛋白酶是一种存在于细胞内的非溶酶体性的限制性蛋白水解酶，与肉的嫩度和风味等食用品质密切相关。钙蛋白酶系统基因是理想的肉质嫩度分子标记[2]。CAPN3基因作为影响肉嫩度的候选基因，其分子生物学特性和生理调控功能是近年来研究的热点之一。CAPN3（Calpain3）是最典型的组织特异性钙蛋白酶，其在骨骼肌细胞中呈现高度表达特异性[3]。Lian等[4]的研究揭示了CAPN3的mRNA水平和蛋白质水平与肉的嫩度之间存在显著相关性。鸭骨骼肌发育过程中，CAPN3基因与肌纤维类型和肌纤维的生长发育密切相关。CAPN3基因的变异影响肉的品质[5]。侯冠彧等[6]对CAPN3基因的5'区域进行SNP检测和基因型分析，初步断定该基因本座位有影响肉牛生长及牛肉嫩度的倾向。Kimberly等[7]发现CAPN3的活性影响鼠肌肉的营养。延边黄牛CAPN3在位点5 556发生G→A突变，导致该位点的脂肪酸和氨基酸含量在不同基因型之间存在差异[8]。CAPN3的活性和表达水平影响肉质嫩度，并且与肢带型肌营养不良密切相关，存在着很强的遗传效应[9, 10, 11]。CAPN3在组织中的表达具有特异性，猪CAPN3和CAST基因在背最长肌中有较高的表达量[20]。姚慧等[13]分析了CAPN1和CAST基因在牦牛不同组织中的表达差异。CAPN3基因在牦牛不同组织中表达情况尚未见报道。
本实验克隆CAPN3基因的CDs区，并进行生物信息学分析，以期为深入研究牦牛CAPN3基因的定位与表达调控奠定基础。同时采用荧光定量PCR技术，检测CAPN3基因在牦牛不同组织的表达量，为进一步揭示CAPN3基因的分子生物学功能提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 组织样、细菌菌株和载体本实验选择3头成年青海省大通牦牛，屠宰后分别采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰脏、背最长肌组织，放入液氮保存。
1.1.2 主要试剂E.coli DH5α购于宝生物公司；pGEM-T easy克隆载体购于Promega公司。TaKaRa反转录试剂盒、Trizol试剂、LA Taq DNA聚合酶购自宝生物工程有限公司，DNA Marker DL2000、DNA纯化回收试剂盒、高纯度质粒小量提取试剂盒、SYBR Green荧光定量试剂盒购于TIANGEN公司。
1.1.3 引物的设计与合成根据GenBank中普通牛CAPN3基因cDNA序列（登录号：149197.1）应用Primer5软件设计引物（表 1），由Sangon公司合成。
以成年牦牛背最长肌为材料，参照RNA提取试剂盒说明书提取RNA。总RNA用无菌DEPC水溶解，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。
1.2.2 PCR扩增与测序RNA反转录为cDNA：反应总体系为10 μL：5×gDNA Eraser Buffer（2.0 μL），gDNA Eraser（1.0 μL），Total RNA（1.0 μL），Rrime Script RT Enzyme Mix（1.0 μL），RT Primer Mix（1.0 μL），5×RrimeScript Buffer（4.0 μL），RNase Free H2O（10 μL）。PCR反应条件为：42℃ 25 min，85℃ 5 s，4℃保存。
PCR扩增双链：总反应体系25 μL：LA Premix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，RNase Free H2O 10.5 μL。PCR反应条件为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸3 min，共30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，连接到pGEM-T easy载体上，16℃过夜。转化E.coli DH5α感受态细胞，接种转化后的DH5α于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养12-16 h后，挑取阳性菌落接种于含有Amp的LB液体培养基中，37℃条件下220 r/min振荡培养8 h，对菌液进行PCR鉴定后，送至Sangon公司测序。
1.2.3 实时荧光定量PCR反应体系和条件根据NCBI中下载的牦牛CAPN3基因（登录号：NM-174260.2）应用Primer5.0设计1对引物（表 1）。实时荧光定量PCR反应体系为10 μL，SYBRI Mix 5 μL，模板cDNA 0.6 μL，上下游引物各0.2 μL，RNase Free H2O 4 μL。PCR反应程序：95℃预变性30 s；95℃变性15 s，60℃退火30 s，40个循环。
2 结果 2.1 CAPN3基因的克隆及理化性质分析PCR产物用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳分析，可见3条DNA片段（图 1），大小分别为2 064、1 057和1 104 bp，与预期DNA片段大小一致。重组质粒测序结果（图 2）表明，本研究克隆测序得到的序列为3 180 bp，通过BLAST比对确定该序列为牦牛CAPN3基因，其中开放阅读框长2 469 bp，编码822个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，CAPN3基因编码的蛋白分子量约为94.58 kD，理论等电点为5.70。含有20种基本氨基酸，其中含量最高的是Glu（7.5%），含量最低的是His（1.9%）；含有带负电荷的残基122个，正电荷残基107个，酸性氨基酸为14.84%，碱性氨基酸为14.96%。
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| M：DL2000 DNA Marker；1-3：PCR扩增产物 图 1 牦牛CAPN3基因PCR扩增产物的电泳图 |
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| 图 2 牦牛CAPN3基因和编码蛋白序列 |
依据氨基酸分值越低亲水性越强和分值越高疏水性越强的规律可知，牦牛CAPN3基因氨基酸序列的第491位Arg具有最低的分值-3.967，其亲水性最强；第481位Phe具有最高分值2.978，其疏水性最强。可知，整个多肽链表现为亲水性（图 3）。
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| 图 3 牦牛CAPN3基因编码蛋白的疏水性预测 |
蛋白信号肽分析表明，CAPN3编码的蛋白不存在信号肽，属于非分泌蛋白。编码蛋白所有氨基酸都位于膜表面，可知其是一种表面蛋白（图 4）。
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| 图 4 牦牛CAPN3基因编码蛋白跨膜分析 |
牦牛CAPN3基因编码蛋白的亚细胞定位分析结果可知，其分布在细胞质和细胞核中的可能性为39.1%，分布在线粒体中的可能性为8.7%，分布在液泡、细胞外基质和细胞骨架的可能性为4.3%。
2.5 牦牛CAPN3基因编码蛋白结构域和蛋白质功能位点预测用Interpro软件对CAPN3基因编码蛋白进行结构域预测，结果（图 5）显示，该序列在56-426氨基酸序列之间有CysPc家族蛋白功能域，在429-583氨基酸序列之间有calpain-Ⅲ家族蛋白功能域，在697-725、727-755、792-820氨基酸序列之间有EFh家族蛋白功能域。运用Netphos软件对CAPN3基因编码蛋白分析，可知该蛋白有25个丝氨酸磷酸化位点，2个苏氨酸磷酸化位点，8个酪氨酸磷酸化位点（图 6）。
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| 图 5 牦牛CAPN3基因编码蛋白结构域预测 |
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| 图 6 牦牛CAPN3基因编码蛋白磷酸化位点预测 |
用SOPMA服务器预测CAPN3基因编码蛋白的二级结构，结果（图 7）表明，该蛋白包含35.64% α-螺旋、43.8%无规则卷曲、15.33%伸展链和5.23% β-转角。可推断α-螺旋和无规则卷曲是牦牛CAPN3编码蛋白主要的二级结构元件。采用同源建模法，结果（图 8）显示，该蛋白主要由α-螺旋、无规则卷曲和β-折叠组成，与二级结构预测结果基本一致。
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| 红色e：伸展链；橘黄色c：无规则卷曲；蓝色h：α-螺旋；绿色t：β-转角 图 7 牦牛CAPN3基因编码蛋白的二级结构预测 |
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| 图 8 牦牛CAPN3蛋白三级结构预测图 |
使用MegAlign软件进行同源性分析（图 9）发现，牦牛CAPN3基因编码蛋白与其他物种CAPN3基因编码蛋白具有很高的同源性，均在90%以上。使用MEGA5.1中的NJ法构建CAPN3基因的系统发育树，结果（图 10）表明，牦牛与黄牛、绵羊和猪在系统发育树种距离较近，这与动物学分类一致。
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| 图 9 不同物种CAPN3蛋白氨基酸序列同源性比较 |
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| 图 10 CAPN3基因的系统发育树 |
CAPN3基因在所检测牦牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰脏、背最长肌组织中均有表达，而背最长肌、胰脏中的表达高于其他组织（图 11）。
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| 图 11 牦牛CAPN3基因在不同组织中的表达量 |
CAPN3作为影响肉质性状的候选基因，近年来得到了越来越广泛的重视，CAPN3 可通过自溶降解肌联蛋白和伴肌动蛋白，在宰后肉的嫩化中扮演重要角色[6]。本研究采用RT-PCR技术，克隆获得CDs区长2 469 bp，其编码822个氨基酸，其编码的蛋白质为亲水性蛋白质，说明该蛋白为水溶性蛋白。亚细胞定位推断牦牛CAPN3基因编码蛋白可能主要在细胞质和细胞核中发挥生物学作用。磷酸化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，蛋白磷酸化与多种生物学过程密切相关[14]，该蛋白有35个磷酸化位点，可推测CAPN3在行使生理化功能前或者与其他蛋白互作时可能需要磷酸化的活化。二硫键可以使不同区域的氨基酸靠拢并形成稳定的空间拓扑结构，同时疏水氨基酸残基围绕着二硫键可形成局部疏水中心，利于形成稳定的高级结构域[15]，这对CAPN3蛋白功能的发挥可以产生重要的影响。在一定的生理条件下，氨基酸序列决定了它的二级结构和空间构象。牦牛CAPN3蛋白由35.64% α-螺旋、43.8%无规则卷曲、15.33%伸展链和5.23% β-转角组成，不同的二级结构元件构成了CAPN3蛋白特定的高级结构，进而可以行使特定的生理生化功能。牦牛与黄牛、绵羊和猪在系统发育树种距离最近，这与Walder等[16]研究结果相似。
据Kinbara等[17]报道，CAPN3在成年动物中几乎只在骨骼肌中表达，而Missa等[11]用免疫印迹法分析小鼠的不同器官（骨骼肌、心脏、肝脏、子宫、肾脏、小肠和肺脏）CAPN3的表达量，发现其在骨骼肌中的表达是受限的[18]。张增荣等[19]研究山地乌骨鸡和商品鸡CAPN3基因在不同组织中的表达，发现CAPN3基因在胸肌和腿肌中的表达量最高，且CAPN3基因在10周龄商品鸡中所有组织的表达量高于10周龄的山地乌骨鸡。刘博洋等[20]研究发现草原红牛脾脏中的CAPN3基因表达量显著高于其他组织。本研究采用实时荧光定量PCR方法对牦牛不同组织中CAPN3基因表达水平差异进行检测，结果显示，CAPN3基因在所检测牦牛的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胰脏及背最长肌7种组织中均有表达，不同组织中表达水平不同。本研究发现所检测的牦牛的各组织中，胰脏、背最长肌中的CAPN3基因表达量显著高于其他组织。因此，背最长肌中CAPN3基因表达量显著高于其他组织，为改良牦牛肉的嫩度提供了理论依据。
4 结论牦牛CAPN3基因的CDs区长2 469 bp，其编码822个氨基酸，其编码的蛋白质为亲水性蛋白质，说明该蛋白为水溶性蛋白。牦牛CAPN3蛋白由35.64% α-螺旋、43.8%无规则卷曲、15.33%伸展链和5.23% β-转角组成，不同的二级结构元件构成了CAPN3蛋白特定的高级结构，进而可以行使特定的生理生化功能。结果显示，所检测的牦牛的各组织中，胰脏、背最长肌中的CAPN3基因表达量显著高于其他组织。
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