黄花蒿（Artemisia annua L.）是菊科蒿属的一年生草本植物，又名香蒿、草青蒿、臭青蒿，其分布广泛、适应性强，具有解暑、退热、治感冒等功效，是我国传统的中草药^[1]。20世纪70年代，我国著名科学家屠呦呦及其工作团队首次从黄花蒿茎叶中分离到一种具有高效抗疟活性的倍半萜内脂类化合物——青蒿素（Artemisinin）^[2]，已被世界卫生组织推荐为防治疟疾的首选药物。青蒿提取物经研究还具有抗炎症、抗氧化、抗菌及抗肿瘤等多种药用价值^[3]。另外，青蒿还可以作为长效无公害的天然绿色农药资源和绿化荒地的优良先锋植物资源^[4]。鉴于黄花蒿在医药开发、农业生产、环境保护方面的重要及潜在价值，目前对黄花蒿及其内生菌资源的应用研究备受关注。

植物内生菌（Endophyte）泛指那些在其生活史中至少一定阶段生活在健康植物组织内部，并不引起明显病害症状的微生物。植物内生菌在长期和宿主共同进化和相互合作过程中，它们的遗传和代谢之间存在一定的相似性和互补性。目前，关于植物内生菌的功能研究，主要集中于产生活性代谢物质、固氮功能、促进植物生长、增强宿主植物抗性、他感作用、生物防治、环境修复及作为外源基因载体等方面^{[5, 6]}。

本文对近年来国内外黄花蒿内生菌的研究工作进行了系统总结，希望为进一步开发和利用黄花蒿内生菌资源奠定良好的文献基础并起到初步的指导作用。

许多植物内生真菌产生的次生代谢产物，如萜类、生物碱、黄酮、甾体及酯类等化合物，具有抗肿瘤活性。Gu等^[7]从黄花蒿茎中分离到一株内生截孔环炭团菌Hypoxylon truncatum IFB-18，其发酵萃取液中的两种新的苯并[J]荧蒽（benzo[j]fluoranthene-based）类化合物daldinone C 和D，可明显地抑制结肠癌细胞株SW1116，且半抑制浓度IC₅₀（Half maximal inhibitory）分别为49.5和41.0 μmol/L。Shen等^[8]对内生露湿漆斑菌Myrothecium roridum IFB-E012发酵液的乙醇提取物通过硅胶柱层析和葡聚糖凝胶过滤等方法进一步纯化并分离出5种化学成分：7，8-二甲基异咯嗪（7，8-dimethylalloxazine，lumichrome）、胡萝卜苷（Daucosterol）、对羟基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid）、尿嘧啶（Uracil）和烟酸（Nicotinic acid）。其中7，8-二甲基咯嗪对人鼻咽癌KB细胞和黄嘌呤氧化酶表现出抑制活性，且IC₅₀分别为14.46 和60.32 μmol/L^[8]。Shen等^[9]从原始定殖于黄花蒿根中的内生露湿漆斑菌IFB-E091的固体培养物中鉴定出一个新的具有细胞毒性的roridin型化合物 trichothecene macrolide（即roritoxin E）和其他3种已知的化合物：7，8-二甲基异咯嗪、（22E，24S）-cerevisterol 和（22E，24R）-6β-methoxy-ergosta-7，22-diene-3β，5α-diol。其中roritoxin E被证明在体外可以抑制胃癌SGC-7901和肝癌SMMC-7721细胞系，且IC₅₀分别为0.26 和10.54 µg/mL^[9]。钱一鑫等^[10]从黄花蒿的根、茎、叶和花中分离到68株内生真菌，分别用MTT法和DPPH法对它们的乙酸乙酯粗提物进行了抗肿瘤和抗氧化活性的测定，共筛选到12株活性内生真菌，分别为子囊菌亚门（Ascomycotina）的链格孢属（Alternaria）、刺盘孢属（Colletotrichum）、拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis）和拟茎点霉属（Phomopsis）。在抗肿瘤活性测试中，对至少一种指示瘤株（HL-60、MCF-7、COLO205）的抑制率达50%以上的内生真菌有8株（PQH5、9、12、18、35、37、53和58）；在抗氧化活性测试中，有5株内生真菌（PQH12、26、41、47和63）显示良好的清除DPPH自由基的活性（IC₅₀<10 mg/mL），并且具剂量依赖性。其中，活性较高的PQH9和PQH12为拟茎点霉属（Phomopsis）真菌，PQH9具有较高的体外细胞毒活性，PQH12同时具有体外细胞毒活性和抗氧化活性，且发酵产量较大。不同活性内生真菌的分布具有相对组织特异性，其中具细胞毒活性的均来自叶片部位，具抗氧化活性的则来自根和茎部位^[10]。Zhang等^[11]首次从黄花蒿内生真菌烟曲霉Aspergillus fumigatus SPS-02发酵液中分离到4种ardeemin 衍生物：5-N-acetylardeemin、5-N-acetyl-15bβ-hydroxyardeemin、5-N-acetyl-15b-didehydroardeemin 和5-N-acetyl-16α-hydroxyardeemin。它们对白血病耐药细胞株 K562/DOX、人肺腺癌顺铂耐药细胞株 A549/DDP和卵巢癌顺铂耐药细胞株 SK-OV-S/DDP的耐药性有不同程度的逆转作用。其中，化合物4在浓度为5 μmol/L时对K562/DOX和A549/DDP细胞株的耐药性有最强的逆转作用，分别达到5.2和8.2倍；然而化合物2对SK-OV-S/DDP细胞株的耐药性有最强的逆转能力，达到10.8倍^[11]。于哲等^[12]通过硅胶、反相及凝胶等分离方法从黄花蒿内生放线菌A5发酵液乙酸乙酯萃取相分离得到4种化合物：吡嗪酮类化合物6-benzyl-3-isopropylpyrazin-2（1H）-one、酪胺生物碱N-（4-hydroxyphenethyl）acetamide和波谱数据为首次报道的3-（4-hydroxyphenyl）-2-[（2-oxotetrahydro-2H-pyran-3-yl）oxy]propanoic acid 及尿嘧啶。对前3种化合物采用海虾幼虫致死性测定发现，在样品浓度为0.1 mg/mL 时，海虾矫正死亡率依次是43.2%、38.3%和43.2%，表明它们均具有一定的细胞毒活性^[12]。由于海虾幼虫致死率与对癌细胞的抑制率之间存在一定的相关性，因此此法可应用于大规模抗癌药物的初步筛选。

植物内生菌可以通过刺激宿主或自身分泌一些特殊的次生代谢产物来提高宿主的抗病能力。Lu等^[13]从黄花蒿茎中分离出一株内生炭疽菌（Colletorichum sp.），可产生8种已知的代谢产物：麦角固醇（ergosterol）（I）、3β，5α，6β-trihydroxyergosta-7，22-diene（II）、3β-hydroxy-ergosta-5-ene（III）、3-oxo-ergosta-4，6，8（14），22-tetraene（IV）、3β-hydroxy-5α，8α-epidioxy-ergosta-6，22-diene（V）、3β-hydroxy-5α，8α-epidioxy-ergosta-6，9（11），22-triene（VI）、3-oxo-ergosta-4-ene（VII）和生长素吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）以及3种新的抑菌代谢物：6-isoprenylindole-3-carboxylic acid、3β，5α-dihydroxy-6β-acetoxy-ergosta-7，22-diene和3β，5α-dihydroxy-6β-phenylacetyloxy-ergosta-7，22-diene。抑菌测试表明化合物1-3和III-V可抑制枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄葡萄球菌（Strphylococcus aureus）、藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）等病原菌，且其抑制浓度范围为25-75 mg/mL；化合物2、3与III和V在50-100 μg/mL时对白色念珠菌（Candida albicans）和黑曲霉（Aspergillus niger）有抑制作用，化合物1-3、III 和IV对小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis）、禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）、根腐病菌（Helminthosporium sativum）和南瓜疫病菌（Phytophthora capisici）等4种真菌有抑制作用^[13]。Liu等^[14]对39株内生菌进行小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis）、小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）、小麦根腐病菌（Helminthosporium sativum）、小麦雪霉叶枯病菌（Gerlachia nivalis）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）和禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）等植物病原真菌的拮抗筛选发现，21株可产生抑菌活性物质，其中内生菌IV403产生的活性最强，有效成分主要集中在乙酸乙酯萃取相^[14]。魏宝阳等^[15]以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及大肠杆菌为测试菌种，从黄花蒿茎叶主要分离出13株内生真菌，分别属于束梗孢目（Stilbellales）、丝孢目（Hyphomycetales）、侧孢霉属（Sporotrichum）、丝核菌属（Rhizoctonia）、曲霉属（Aspergillus）、拟青霉属（Paecilemyces）、链格孢属（Alternaria Nees）、青霉属（Penicillium）、毛霉属（Mucor）等。对它们的次生代谢产物进行抗菌活性筛选发现，活性成分多集中于乙酸乙酯相；其中12 株的代谢产物至少对1种受测菌具有抑菌活性，而且有2 株对测试病原菌均有较强抑制作用^[15]。田小曼等^[16]以番茄灰霉病菌（Botrytis cirerea）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、苹果炭疽病菌（Glomerella cingulata）、西瓜枯萎病菌（Fusarium ozysporum）、西瓜炭疽病菌（Colletetrichum orbiculare）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、油菜菌核菌（Sclerotinia sclerotiorun）、玉米弯孢病菌（Curvularia lunata）等8种病原真菌作为靶标菌，对从青蒿的根、茎、叶中分离到的67株内生菌（细菌43株、真菌16株、放线菌8株）进行抗菌活性检测，筛选到1株抗菌活性较高的内生真菌G2、9株内生细菌和3株内生放线菌。作为重点研究的G2为子囊菌门的炭疽菌属（Colletetrichum）真菌，经分析其发酵代谢产物中抑菌活性成分可能为生物碱、内酯、香豆素和有机酸^[16]。Zhang等^[17]以大肠杆菌、金黄葡球菌、红色毛癣菌（Trichophyton rubrum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia cerealis），稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）为供试病原菌，通过对分离得到的11株内生真菌的提取物抑菌活性研究发现，曲霉菌属Aspergillus sp. SPS-02、头孢霉属Cephalosporium sp. SPS-08、毛霉属Mucor sp. SPS-10和-11有较为广泛的抑菌效果；Aspergillus spp. SPS-02，-04和-01提取物分别对大肠杆菌、金黄葡球菌、红色毛癣菌有最强的抑制活性；SPS-11提取物对立枯丝核菌有最明显效应；SPS-02 和 -08提取物对稻瘟病菌有最强抑制活性^[17]。李洁^{[18, 19]}相对系统地分析了黄花蒿内生放线菌（228株）的抗菌活性。以大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌（Candida albicans）以及玉蜀黍长蠕孢菌（Helminthosporium maydis）、燕麦镰孢菌（Fusarium avenaceum）、炭疽病菌（Colletotrichum sp.）、苹果腐烂病菌（Cytospora mandshurica）4种植物病原菌为指示菌进行检测，结果显示所有的供试菌株对大肠杆菌均无抑制活性，具有至少一种抗菌活性的菌株占51.3%；其中31个菌株（YIM 65679-65681、65683、65694、65703、65704、65706、65708-65711、65716、65724、65727、65729、65745、65758、65762-65772）具有较强的广谱抗菌活性，它们的发酵产物对5种以上的指示菌均有较强抑制活性；菌株YIM 65784和65810的发酵产物分别对玉蜀黍长孺孢菌和苹果腐烂病菌表现出最强抑制活性，抑菌圈直径分别达到2.4和3.6 cm^{[18, 19]}。

另外，内生菌也可以通过交叉保护（Cross-protection）来提高宿主对强致病菌的抗性。活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的产生是植物体响应外界胁迫的普遍特征，有助于植物建立系统获得性抗性（Systemic acquired resistance，SAR），但超过阈值的ROS水平将会对植物体内的生物大分子DNA、脂类和蛋白等造成氧化损伤，导致细胞程序性死亡。过氧化物酶在调控植物防御反应早期的ROS的水平发挥重要作用，赋予植物广谱的病原菌抗性^[20]。SAR是水杨酸（Salicylic acid，SA）介导的植物对病原物的广谱抗病反应。Lin等^[20]从黄花蒿地上部分筛选到两株内生链霉菌Streptomyces sp. IFB-A02和IFB-A03，且它们也可以定殖到拟南芥中，但接种IFB-A02的拟南芥幼苗长势弱于接种IFB-A03的植株，相应地，接种IFB-A02的叶片有较高水平的过氧化物酶活性和ROS释放。对IFB-A03菌株的进一步研究发现，预接种IFB-A03可以诱导SAR标记基因PR-1、PR-5的转录水平，活化水杨酸介导的应对病原菌挑战接种的植物SAR反应，从而增强拟南芥对疥疮链霉菌（Streptomyces scabies）的次级防御能力，同时接种IFB-A03能够部分拯救拟南芥突变体eds5（enhanced disease susceptibility 5）防御缺陷的表型。因此，IFB-A03菌株未来有望作为一种潜在的生态友好型生物防治制剂加以应用^[20]。

植物内生菌可以通过直接产生目标代谢产物，或刺激宿主的相关生物合成途径或促进宿主总生物量的增加来间接达到提高目标代谢产物的产量。Wang等^[21]发现内生刺盘孢属真菌Colletotrichum sp. B501细胞壁寡糖提取物对于生长22 d的黄花蒿发根中青蒿素的合成具有促进作用，且诱导处理4 d后，发根青蒿素含量最高达1.15 mg/g，比对照增加了64.29%。电子X射线显微分析（Electron X-ray microanalysis）发现Ca²⁺在发根皮层细胞急剧积累。在诱导处理第1天，发根中的氧化物酶活性急剧提高；3 d后，部分细胞形态发生改变，包括皱缩、胞质凝聚、细胞核崩解及核DNA呈梯度降解等，这显示了内生菌细胞壁寡糖提取物诱发细胞编程性死亡，可能为青蒿素生物合成提供物质或化学信号^[21]。王剑文等^[22]发现黄花蒿内生胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）菌丝体寡糖提取物也可显著促进发根青蒿素的合成，培养23 d的发根处理4 d后，青蒿素含量可达13.5 mg/L，比对照的产量提高51.63%^[22]。因此，寡糖化合物可能是植物内生菌与宿主互作的一类重要信号分子，可以作为在植物细胞培养中次生代谢物合成的诱导剂。袁亚菲等^[23]将黄花蒿内生青霉菌Penicillium sp. Y2悬浮培养5 d，分别将离心后所得培养液与菌丝匀浆后经高压灭菌处理、培养液经高压灭菌或过滤除菌处理获得3种内生菌诱导子（A、B和C）。经测试发现这3种诱导子对经诱导处理3周的黄花蒿组培苗的生物量、抗氧化酶活性和青蒿素含量均有促进作用，其中诱导子C的刺激作用最显著，促进组培苗的干重增长44.44%，诱导超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和过氧化物酶POD活性，青蒿素含量提高了58.86%，达到4.701 mg/g（干重）^[23]。陈思安^[24]从黄花蒿丛枝菌根中分离到3种内生真菌：茄病镰刀菌（Fusarium solani）、尖抱镰刀菌（Fusarium oxysporum）和嗜松青霉菌（Penicillium pinophilum）。通过单株或复合浇菌可以有效增加青蒿的叶绿素含量、总生物量及青蒿素含量。其中复合接菌的效果优于单株接菌，最高可使青蒿素含量提高123.5%^[24]。李洁等^[25]将内生放线菌Pseudonocardia sp. YIM 63111回接黄花蒿幼苗，并使用绿色荧光蛋白eGFP标记YIM 63111在黄花蒿体内的分布情况，发现其主要定殖于根部，而且接种的浓度与根的生长情况呈负相关。定量PCR检测表明回接YIM 63111可以显著刺激青蒿素合成关键基因细胞色素P450单加氧酶 CYP7AV1和氧化还原酶ASQS的表达，从而促进植物体内青蒿素的生物合成并增加其含量^[25]。

其实，黄花蒿内生菌资源具有广泛的潜在应用价值。李洁^[18]对供试的199株黄花蒿内生放线菌进行了多种酶活测定发现，有44株具淀粉酶活性（占22.1%），90株具蛋白酶活性（占45.2%），53株具纤维素酶活性（占26.6%），76株具脂肪酶活性（占38.2%）。其中7株（YIM 65627、65633、65649、65590、65648、65634和65604）具有较强淀粉酶活性（透明圈宽度>0.5 cm）；10株（YIM 65633、65621、65612、65594、65637、65614、65672、63585、65748和65619）具有较强蛋白酶活性（透明圈宽度>0.5 cm）；7株（YIM 65708、63596、65627、63587、65693、65598和65751）具有较强纤维素酶活性（透明圈宽度≥1.0 cm）；1株（YIM 65757）具有较强脂肪酶活性（透明圈宽度>0.5 cm）。另外，在117株内生放线菌中检测到19株能完全抑制稗草（Echinochloa crusgalli）萌发，包括11株链霉菌（YIM 65703、65714-65717、65736、65746、65768、65769、65771及63600）和8株其他类型的菌（YIM 63587、63553、65681、65684、63590、65744、65685及65742），这为开发和利用新型无公害的微生物源除草剂提供了广泛的菌种资源^{[18, 19]}。

植物内生菌由于其生活微环境的特殊性，造就了其独特的有别于外界微生物的遗传和代谢背景。它们因此构成了一个巨大的微生物遗传信息库，也潜在隐藏了大量的未经鉴定的新物种，为微生物的开发应用提供了新的物种资源。近年来，一些科研工作者已对黄花蒿内生菌的资源进行了初步的鉴定和属的划分。刘金花等^[26]从黄花蒿的根、茎和叶中共分离内生菌80株，其中内生真菌37株分属5个属，包括囊孢菌（Capsule）、头孢霉（Cephalosporium）、弯孢霉（Curvularia）、曲霉（Aspergillus）和毛霉（Mucor），内生细菌40株分属7个属，包括泛菌（Pantoea）、土壤杆菌（Agrobacterium）、假单胞菌（Pesudomonas）、芽孢杆菌（Bacillus）、巴斯德氏菌（Pasteurella）、葡萄球菌（Staphylococcus）、黄杆菌（Flavobacterium），内生放线菌3株有2个属，包括诺卡氏菌（Nocardia）和链霉菌（Streptomyces）。黄花蒿内生菌的数量和种类在不同组织器官的分布存在较大差异^[26]。李洁^{[18, 19]}从黄花蒿全株样品中共分离出内生放线菌228株，分别属于链霉菌属（Streptomyces，占分离总数的53.9%）、原小单孢菌属（Promicromonospora，11.4%）、假诺卡氏菌属（Pseudonocardia，6.6%）、诺卡氏菌属（Nocardia，4.8%）、野野村氏菌属（Nonomuraea，4.4%）、红球菌属（Rhodococcus，3.5%）、韩国生工菌属（Kribbella，3.1%）、小单孢菌属（Micromonospora，3.1%）、马杜拉放线菌属（Actinomadura，2.6%）、链孢囊菌属（Streptosporangium，1.3%）、拟无枝菌酸菌属（Amycolatopsis，1.3%）、指孢囊菌属（Dactylosporangium，0.9%）、芽生球菌属（Blastococcus，0.4%）、糖霉菌属（Glycomyces，0.4%）、考克氏菌属（Kocuria，0.4%）、微球菌属（Micrococcus，0.4%）、戈登氏菌属（Gordonia，0.4%）、小双孢菌属（Microbispora，0.4%）共18个已知属和1个潜在新属Phytomonospora（0.4%）。链霉菌的分离频率最高，原小单孢菌次之。而且，部分新的黄花蒿内生菌物种已得到详细鉴定但功能仍待调查，如假诺卡氏菌属YIM 63101^T（Pseudonocardia bannaensis sp. nov.）^[27]、YIM 63158^T（P. kunmingensis sp. nov.）^[28]、YIM 63233^T（P. serianimatus sp. nov）^[29]、YIM 63587^T（P. artemisiae sp. nov.）^[30]、YIM 63235^T（P. antimicrobica sp. nov.）^[31]、YIM 63638^T（P. xishanensis sp. nov.）^[32]，链霉菌属YIM 63135 ^T（Streptomyces artemisiae sp. nov.）^[33]、YIM 65594^T（S. endophyticus sp. nov.）^[34]、YIM 65638^T（S. endophyticus sp. nov.）^[34]、YIM 65642^T（S. endophyticus sp. nov.）^[34]，诺卡氏菌属YIM 65623^T（Nocardia artemisiae sp. nov.）^[35]，野野村氏菌属YIM65601^T（Nonomuraea endophytica sp. nov.）^[36]，红球菌属YIM65754^T（Rhodococcus artemisiae sp. nov.）^[37]和一个新属新种YIM65646^T（Phytomonospora endophytica gen. nov.，sp. nov.）^[38]。这些新的内生菌物种的发现不仅丰富了人类对微生物多样性的理解，而且为潜在的工农业应用提供了更多的资源和选择。

迄今为止，黄花蒿内生菌的鉴定和开发已经取得了一定的成效，主要集中在抗癌、抗氧化、抗病原菌和促青蒿素产生等方面，在医药开发和生物防治领域具有重大应用价值。但是，为了进一步深入挖掘黄花蒿内生菌资源，仍有许多问题亟待解决：（1）由于不同地域、不同季节、不同生长阶段、不同部位、不同品系的黄花蒿均有可能存在独特的内生菌群体，因此很难做到百无一漏获取全部黄花蒿内生菌资源。再加上内生菌所定殖微环境的特殊性，所以培养条件的模拟程度将直接关系到菌株分离的多寡和成败。（2）目前关于黄花蒿内生菌的研究多停留在初级的粗体物活性分析层面，缺乏对具体有效成分的提纯及作用机理和分子机制的深入探讨。因此，对黄花蒿及其内生菌全基因组测序的开展将有利于鉴定相关代谢通路的基因或关键酶，为进一步开发和利用黄花蒿内生菌资源提供充分理论支持和基因信息。（3）内生菌和宿主之间的长期共生可能导致两者存在相似或互补的调控和代谢途径，因此对黄花蒿内生菌的研究可以尝试在宿主的背景下进行，探索两者在分子层面互作的机制，为新的代谢途径和关键酶的发掘提供契机。（4）黄花蒿中通常存在多种内生菌，它们之间不同的组合是否有更强的应用价值需要进一步探索。（5）黄花蒿及其内生菌可以作为一个很好的模式系统来研究内生菌与其宿主的共进化，具有重要的理论意义。（6）鉴于黄花蒿还具有独特的挥发性香味、抗逆性强、生物量大等特性，因此，很有必要对其内生菌的非药用价值进行广泛挖掘和综合应用。