水分是限制陆地生态系统生产力的主要环境因子，而植物自身对水分的调节能力决定了它们对环境压力的耐受性，很多环境因子如干旱、盐碱和极端温度都将影响植物各种生理过程中对水分的吸收、转运、储存和利用。水孔蛋白（Aquaporins，AQPs）是广泛存在于动物、植物、微生物细胞膜上转运水分子的特异通道蛋白，属于MIP（Majorintrinsic protein）家族。人们最早在动物中发现并命名为AQP[1]，主要是研究它的水通道作用。然而在对植物AQP 的研究中发现AQPs 不仅能特异性的转运水分子[2, 3]，还能转运甘油、H2O2、尿素、NH3、CO2 等多种物质[4, 5, 6, 7, 8]，并且对植物的生长、发育、适应环境变化等方面[9, 10, 11, 12]也有着重要的作用。在植物基因组研究中发现，拟南芥中有35 个AQPs、水稻有33 个AQPs、玉米36 个AQPs，苔藓23 个AQPs，番茄37 个AQPs、白杨55 个AQPs[13, 14, 15] 根据氨基酸序列的同源性及结构特征，植物AQP 通常分为5 类：质膜内在蛋白（Plasma membrane intrinsicproteins，PIPs）；液泡膜内在蛋白（Tonoplast intrinsicproteins，TIPs）；类 Nod26 膜内在蛋白（Nodulin 26-like intrinsic proteins，NIPs） 存在于根瘤菌和豆科植物的共生膜上；小分子碱性膜内在蛋白（Smalland basic intrinsic proteins，SIPs）； 以及类GlpF（Glycerolfacilitator） 膜内蛋白（GlpF-like intrinsicproteins，GIPs）[16]。质膜内在蛋白（PIPs） 作为AQP 家族中的重要成员之一，包含sikPIP1 和PIP2 两个子类。研究表明，它们不仅参与细胞对外界水分的选择性运输，而且对植物生长过程中的干旱、低温等胁迫都有重要的作用[17, 18, 19, 20]。Zhang 等[21]研究发现在酵母细胞和拟南芥中过表达棉花GhPIP2 ；7 基因能显著提高其对干旱的耐受能力。李嵘等[22]在水稻中过表达 OsPIP2 ；6，在干旱、低氧、高盐等逆境胁迫下转基因植株耐受能力均显著高于野生型，植株中OsPIP2；6 的表达量也明显增高。Matsumoto 等[23]发现sikPIP1 过表达水稻植株比野生型对寒冷有更强的耐受。
新疆雪莲（Sasussured involucrata Kar. et Kir），属菊科（Compositae）菜蓟族（Trib. Cynareae Less.）凤毛菊属（Saussurea DC.）雪莲亚属；多年生一次性开花结实的高山冰缘宿根草本植物。主要生长在海拔2 400-4 100 m 的高山冰渍石、流石滩、石隙、悬崖峭壁以及沙质湿地中[24, 25]。新疆雪莲能在常年低温、低氧、强紫外且气候复杂多变的情况下完成生活史，其自身形成了一套与环境相适应的响应机制，并且在抵抗的过程中自身也具有与之有关的抗逆基因[26, 27, 28]，从而使雪莲得以适应环境。因此，对天山雪莲基因功能的研究，不仅可以了解天山雪莲特殊的生理机能，而且通过基因工程手段将天山雪莲的基因转入农作物中，对培育抗逆作物也提供了一种有效的途径。
目前，针对PIPs 的研究大多是关注其水分运输以及逆境胁迫下的内源表达，对单个基因的功能，以及外源表达研究较少。为进一步研究质膜内在蛋白基因PIPs 与低温、干旱的关系，本研究从新疆雪莲cDNA 文库中克隆质膜内在蛋白基因sikPIP1，构建植物表达载体pBI121-sikPIP1，通过农杆菌介导转化烟草，水分胁迫进行抗旱性分析和冷冻胁迫进行抗寒性分析，旨在进一步了解sikPIP1 基因对逆境的耐受性，从而为水孔蛋白研究和利用提供理论依据与奠定实验基础。
1 材料与方法1.1 材料大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、农杆菌GV3101、植物表达载体pBI121、‘NC89’野生型烟草（Nicotiana tabacum L.）由石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室保存。克隆载体pGM-TEasy 购自天根生物公司。其它试剂均为国产或进口分析纯试剂，引物合成、测序均由上海生物工程公司进行。
1.2 方法 1.2.1 sikPIP1 基因的克隆从已建立的天山雪莲cDNA 文库中随机挑取单克隆，采取通用引物M13进行PCR 扩增并测序。选择与水孔蛋白基因同源的序列作为模板，利用Primer5.0 设计PCR 引物PP1和PP2。PP1 ：5'-TGCTCTAGAGCATGAGTTTTAGAGAGAGAAATGTCG-3'（Xba I），PP2 ：5'-TGCGAGCTCATTAATTTGTAGCATTGCTTCTGA-3'（Sac I）。采用Tiangen 公司的Trizol 总RNA 提取试剂，提取天山雪莲的总RNA，以Oligo dT 为引物将RNA 反转录成cDNA，以PP1 和PP2 为引物进行PCR 扩增。PCR反应程序为：94℃ 预变性5 min ；94℃ 变性45 s，61℃复性30 s，72℃延伸45 s，35 个循环；72℃延伸7 min ；4℃保温。PCR 产物经1.0% 的琼脂糖凝胶电泳分离后，目的片段命名为sikPIP1 ；使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因；将回收的目的片段连接至载体pGM-T Easy，将阳性克隆命名为pGMsikPIP1；酶切鉴定后送上海生工测序。利用DNAman软件分析测序结果序列，确定开放阅读框，推导相应的多肽序列。蛋白质氨基酸比对在NCBI 的BlastT中分析；运用Mega 软件对推导的多肽序列与已知报道的植物氨基酸序列进行系统进化分析。
1.2.2 植物表达载体的构建与转化用Xba I/SacI 双酶切重组质粒pGM-sikPIP1 和植物表达载体pBI121，1% 的琼脂糖凝胶电泳后，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因和载体大片段。两片段经T4 DNA 连接酶16℃连接过夜，重组子转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，含卡那霉素（60 mg/L）的平板培养过夜，挑选单菌落培养，PCR 检测，提取PCR 检测为阳性质粒并进行酶切鉴定。鉴定为双阳性的质粒即是pBI121-sikPIP1，将重组质粒用电击法转入农杆菌GV3101。
1.2.3 转基因烟草的获得及鉴定经农杆菌pBI121-sikPIP1/GV3101 介导叶盘法转化烟草‘NC89’，获得再生植株，移栽入营养土中。采用CTAB 法提取再生烟草植株的基因组DNA，以pBI121-sikPIP1 质粒为阳性对照，野生型受体DNA 为阴性对照，对目的基因进行PCR 检测。用TRIzol 法提取PCR 检测结果为阳性的烟草植株以及受体烟草的总RNA，采用RT-PCR 检测目的基因的转录水平。
1.2.4 转基因烟草水分胁迫实验选择室内培养2个月，长势相近的野生型烟草和来自不同株系的转sikPIP1 烟草各3 株。实验前充分浇水，待底部托盘无水分进出时开始计时，进行自然干旱处理。停止供水13 d，第14 天复水，实验共进行16 d。从第1天断水开始，每隔3 d 根据李合生[29]的方法测量一次相对电导率、丙二醛、叶片相对含水量，实验重复3 次，并记录烟草形态变化。
1.2.5 转基因烟草冷冻胁迫实验整体植株的冷冻处理，选择室内培养2 个月，长势相近的野生型烟草和来自不同株系的转sikPIP1 烟草各3 株，分别放入4℃、0℃、-2℃和-4℃的生化培养箱进行冷冻胁迫，4℃处理12 h，0℃、-2℃和-4℃处理4 h。记录各阶段烟草形态变化，测定烟草相对电导率和丙二醛含量，实验重复3 次。
1.2.6 数据分析所有数据处理均用Excel2003 和SPSS Statistics 软件分析处理，氨基酸序列分析用DNAman、Mega 以及在线工具完成。
2 结果2.1 sikPIP1基因的克隆与分析以天山雪莲cDNA 为模板，利用设计好PCR 引物PP1 和PP2 进行RT-PCR 扩增，获得大小约为880 bp DNA 片段，将目的片段sikPIP1 克隆于pGM-TEasy 载体，获得pGM-sikPIP1，用Xba I/Sac I 双酶切鉴定，证明新疆雪莲水孔蛋白基因sikPIP1 克隆成功。测序结果分析表明，sikPIP1 基因的最大开放阅读框为840 bp，编码279 个氨基酸，分子量为29.01 kD，pI 为9.26。
目前研究发现在PIP、TIP、NIM 和SIP 四个亚家族中都具有共同的特征，即都有6 个跨膜区、较短的保守AA 基序PA 和信号序列SGXHXNPAVT[30]。序列分析（图 1）表明，sikPIP1 不但具有MIP 家族信号序列GGGANXXXXGY 和TGI/TNPAR-框Ⅰ、框Ⅲ和框Ⅴ分别表示MIP 家族信号序列SGxHxNPAVT 和典型的质膜信号序列GGGANxxxxGY 及TGI/TNPARS/FGAAI/VI/VF/YN ；框Ⅱ和框Ⅳ分别表示一个潜在的PKA 磷酸化位点（Ser113）和一个潜在的PKC 的磷酸化位点（Ser186）SI/FGAAI/VI/VF/YN[12]。此外，序列分析还表明sik-sikPIP1 具有一个PKA 磷酸化位点（Ser113） 和一个PKC 的磷酸化位点（Ser186）。
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| 图 1 sikPIP1 的氨基酸序列 |
根据推定的天山雪莲质膜水孔蛋白基因sikPIP1多肽序列在NCBI 进行BLAST 比对，挑选同源性高的比对结果，利用Mega 软件构建不同物种间植物水孔蛋白基因的分子进化树（图 2）发现，该蛋白与葡萄（Vitis vinifera）、无梗花栎（Quercus petraea）、甜菜（Beta vulgaris）亲缘关系最近，此外还与拟南芥（Arabidopsis thaliana）、陆地棉（Gossypium hirsutum）、胡桃（Juglans regia）等不同科属间植物亲缘关系较近，说明水孔蛋白基因在物种间进化比较保守，比对发现这些基因多为PIP2 亚家族，因此可推测雪莲水孔蛋白基因sikPIP1 也应属于PIP2 亚家族。
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| 图 2 sikPIP1 蛋白系统发育树 |
用Xba I/Sac I 双酶切植物表达载体pBI121 和阳性克隆载体pGM-sikPIP1，构建植物表达载体pBI121-sikPIP1。提取PCR 鉴定为阳性菌落的质粒，用Xba I/Sac I 进行双酶切鉴定（图 3），证明植物表达载体pBI121-sikPIP1 构建成功。构建成功的植物表达载体通过电击法转化农杆菌GV3101，挑选单菌落进行PCR 鉴定（图 4）。
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| 图 3 pBI121-sikPIP1 质粒酶切鉴定 |
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| 图 4 pBI121-sikPIP1/GV3101 PCR 检测 |
以野生型烟草“NC89” 为受体，用农杆菌pBI121-sikPIP1/GV3101 介导转化，经卡那霉素筛选获得抗性再生植株，移栽入营养钵。对移栽烟草植株进行PCR（图 5）和RT-PCR 鉴定（图 6）。将鉴定结果均为阳性的烟草进行进一步的生理指标测定。
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| 图 5 pBI121-sikPIP1 转基因烟草PCR 检测 |
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| 图 6 pBI121-sikPIP1 转基因烟草RT-PCR 检测结果 |
野生型烟草基部开始出现轻度萎蔫，叶片由下而上开始出现黄化，第10天已经严重萎蔫，第13 天野生型烟草整株萎蔫；而转基因烟草第10 天才出现轻度萎蔫现象，第13 天叶片中度萎蔫（图 7），复水2 d 后转基因烟草恢复情况明显优于野生型烟草。可见，转雪莲sikPIP1 基因烟草比对照野生型烟草表现出更强的耐旱性。
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| 图 7 水分胁迫下野生型烟草与转sikPIP1 基因烟草的形态 特征 |
对水分胁迫下各阶段转sikPIP1基因烟草和野生型对照烟草的相对电导率、丙二醛（MDA）含量、相对含水量进行检测，结果（图 8）表明，转基因烟草在水分胁迫中表现出较强的抗旱性。除第1 天外，转基因烟草的相对电导率和MDA含量均低于野生型烟草，随着胁迫时间的增长，转基因烟草和野生型烟草的相对电导率和MDA 含量都呈逐渐上升趋势，但野生型增加幅度和速度均大于转基因烟草，且差异显著（p<0.05）。转基因烟草的叶片相对含水量则高于野生型烟草，随着胁迫时间的延长，转基因烟草和野生型烟草的相对含水量均表现出下降趋势，野生型下降速度和幅度均大于转基因烟草。结果表明，转基因烟草比野生型烟草有更强的耐旱性。生理指标变化与形态特征变化保持一致，表明外源导入雪莲sikPIP1 基因，能够提高烟草抗旱性，减少水分亏缺对植物的伤害。
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| 图 8 水分胁迫下野生型烟草和转基因烟草植株的生理指标 变化 |
4℃处理12 h 野生型烟草与转基因烟草表型均无明显变化，0℃处理4 h 野生型烟草叶片出现少量伤斑，转基因烟草仍无明显变化；-2℃处理4 h 转基因烟草叶片出现伤斑，组织出现轻微疲软，野生型烟草叶片严重萎蔫；-4℃处理4 h 转基因烟草出现中度萎蔫，野生型烟草出现整株萎蔫（图 9）。表明转入sikPIP1 基因能提高烟草对低温的耐受能力。
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| 图 9 同温度胁迫下野生型烟草和转sikPIP1 基因烟草的 形态特征 |
在温度胁迫实验中，对不同温度处理的野生型烟草和转基因烟草进行电导率和丙二醛含量的测定（图 10）。全过程中野生型烟草的相对电导率和MDA 含量都高于转基因烟草，且随着温度的降低野生型烟草和转基因烟草的相对电导率和MDA 含量均呈上升趋势；4℃处理下野生型烟草与转基因烟草的相对电导率和MDA 差异均不大；但在0℃、-2.0℃和-4.0℃处理下，野生型烟草的电导率和MDA 上升速度与幅度均高于转基因烟草，且差异显著（p<0.05）。表明转基因烟草膜脂受伤程度较低，抗寒性相对较高，与形态特征结果保持一致，说明转入雪莲sikPIP1 基因能提高烟草对低温的耐受性，降低植物在低温中的伤害。
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| 图 10 温度胁迫下野生型烟草和转基因烟草植株的生理指标变化 |
AQP 作为重要的生物膜功能蛋白，参与了多种重要的生理过程。其调节机制主要分为两种：一是通过调节AQP 活性进行调节（如磷酸化、激素和Ca2+ 等）；二是改变膜上AQP 数量进行调节。近年来植物AQP 的相关研究备受关注，越来越多的植物AQP 被成功分离、并进行功能分析和调控机理的解析。植物AQP 在受到不同环境因子或存在物种差异等因素时，往往表现出不同的反应，因此研究植物AQP 在植物对不同环境因子（尤其是对水分和温度）适应中所起的作用就具有重要的意义。
AQP 对于植物的最主要作用是水分运输，在水分亏缺情况下，AQP 在植物应对水分胁迫的应答机制中起着重要的作用。Aharon 等[31]通过对转入拟南芥sikPIP1b 的转基因烟草研究发现，正常情况下，转sikPIP1b 烟草长势优于对照，在干旱胁迫下，sikPIP1b 超表达为负作用，植株萎蔫速度快于对照。本研究对转新疆雪莲sikPIP1 基因烟草干旱胁迫发现，转基因植株抗旱能力明显优于对照，这与李嵘等[22]和Zhang等[21]外源表达PIP 基因结果一致。说明AQP 在植物响应水分胁迫时表现出不同的功能。
目前对植物低温耐受性研究主要集中在冷害（0℃以上低温）的研究中，本研究选择耐寒植物新疆雪莲为材料克隆水孔蛋白sikPIP1 基因并转化烟草，结果发现转基因烟草抗寒（冰点以下低温）能力明显增强，这一结果与焦天奇等[26]克隆的雪莲水孔蛋白sikPIP3 基因在烟草中表达结果一致，Lin等[32]在拟南芥中表达另一种耐寒植物人参的液泡膜水孔蛋白基因PgTIP1 结果发现，过表达PgTIP1基因提高拟南芥的抗盐和抗旱能力，并展示出了更低的耐受温度。干旱和低温主要影响植物对水分的运输，在前人外源表达sikPIP1 与PIP2 基因的研究中发现PIP2 基因比sikPIP1 基因有更强的水通道特性，而sikPIP1 与PIP2 形成的异源四聚体比PIP2 形成的同源四聚体也有更高的水透性，这一结果在水稻和玉米中都得以证实，说明sikPIP1 与PIP2 基因间存在协同作用[23, 33]，而雪莲的sikPIP1 基因与PIP2 基因间是否也存在这种协同作用，同时外源表达这两个基因能否进一步提高植株的抗逆能力，选择抗逆性强的基因材料来源是否可以表现出内源表达相似的结果，并且sikPIP1 基因是否与其他抗逆基因间也存在这种协同作用值得我们进一步研究。
4 结论本研究克隆了新疆雪莲水孔蛋白基因sikPIP1，并成功转化烟草。对获得的转基因植株进行逆境胁迫实验，结果表明，与野生型相比较，转sikPIP1 基因烟草显著增强了对干旱和低温逆境条件的适应性。
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