苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种广泛分布的革兰氏阳性细菌，在形成芽胞的同时能产生由cry 或cyt 基因编码的杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs），对多种害虫有特异杀虫活性^{[1, 2]}。目前，Bt 不仅被开发成生物农药在害虫防治中得到应用，表达Bt Cry 蛋白的转基因抗虫植物也已经被广泛种植，实现了巨大的经济效益与生态效益。其中，Cry1A 是一个对鳞翅目害虫有高活性的杀虫蛋白家族，目前已知的Cry1A 类基因有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ad、cry1Ae、cry1Af、cry1Ag、cry1Ah、cry1Ai 及cry1Aj 等10 个模式种类，112 个杀虫基因，编码130 kD 左右的蛋白（http ：//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/）。这些基因中cry1Ab、cry1Ac 应用最为广泛，cry1Ah 是中国农业科学院植物保护研究所克隆的具有自主知识产权的杀虫基因（专利号：ZL20041000-9918.9），其编码的 Cry1Ah 蛋白对棉铃虫（Helicoverpaarmigera）、亚 洲 玉 米 螟（Ostrinia furnacalis）和水稻二化螟（Chilo suppressalis）等多种鳞翅目害虫具有很高的毒杀活性，超过目前商业化的 cry1Ab、cry1Ac 等基因^{[3, 4]}，具有巨大的应用前景，目前正在利用其进行转基因抗虫植物研究^{[5, 6, 7]}。

Cry1A 类蛋白属于典型的3 个结构域蛋白（3Domain，3D）。结构域I 由7 个α 螺旋组成（其中6个两性螺旋围绕1 个中心螺旋）；结构域II，也称作β“三棱镜”，由3 个β 折叠片对称折叠形成一个“希腊钥匙”形状的结构；结构域III，是一种两个反平行的 β-折叠片包裹在一个类似“ 果冻卷”中的结构。研究结果表明，结构域I 与蛋白插入细胞膜以及形成穿孔有关，结构域II 和III 都与受体识别及结合有关，决定杀虫特异性。对目前已经明确杀虫活性蛋白的各结构域进行序列比对聚类发现，部分杀虫活性（特别是Cry1 类蛋白）可以由结构域III 的重组获得，Cry 毒素结构域交换是一种杀虫特异性进化的机制。

通过序列比对发现，Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah三个蛋白之间有共同的结构域II（序列一致性大于97%）；Cry1Ab、Cry1Ac 有共同的结构域I（ 序列一致性为98%）；而Cry1Ac、Cry1Ah 有共同的结构域III（序列一致性为100%）。Cry1Ab 结构域III 与Cry1Ac、Cry1Ah 不同，但是在Cry1A 家族中比较常见，与Cry1Aa、Cry1Ae、Cry1Af 等蛋白结构域III序列一致性大于97% ；Cry1Ah 结构域I 比较独特，不仅与Cry1Ab、Cry1Ac 不同，与所有报道的Bt 杀虫蛋白的结构域I 差异都较大（序列一致性都小于72%）。本研究通过同源建模的方法比较Cry1Ab 和Cry1Ah 结构域I 结构、表面电荷分布特点；进一步构建Cry1Ab 和Cry1Ah 的杂合蛋白并测定杀虫谱，分析结构交换对Cry1Ab 和Cry1Ah 杀虫活性的影响，旨在对进一步揭示Cry1A 类蛋白杀虫特异性进化规律奠定基础。

本研究所用到的菌株和质粒，见表 1。

表 1 菌株与质粒

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LB 培养基：1.0% 胰蛋白胨，0.5% 酵母提取物，1.0% 氯化钠，pH7.0。ZYP-5052 培养基和50×5052 诱导剂。Primer star高保真DNA 聚合酶购自宝生物工程大连有限公司（TaKaRa/Japan），限制性内切酶、DNA 连接试剂盒、DNA 回收试剂盒等购自Axygen 公司（Axygen/USA）。1.1.3 供试昆虫 敏感种群小菜蛾由本实验室提供；棉铃虫、亚洲玉米螟分别由中国农业科学院植物保护研究所棉花害虫组和玉米害虫组提供；甜菜夜蛾由武汉科诺公司提供。

首先将要分析蛋白氨基酸序列提交NCBI 保守结构与数据库（Conserved Domain Database，CDD）进行比对，获取蛋白中对应Endotoxin_N，Endotoxin_M，Endotoxin_C 三个结构域的氨基酸序列，并通过BLAST 的方法比较杀虫蛋白氨基酸序列间的一致性。进一步利用SWISS-MODEL（http ：//swissmodel.expasy.org/）对3 个结构域对应氨基酸序列进行自动建模，获得的三维结构进一步用PyMOL 软件包进行结构比对与表面特性分析。1.2.2 杂合蛋白构建 采用无缝克隆的方法构建Cry1Ah 与Cry1Ab 杂合蛋白AhAhAb，杂合蛋白具备Cry1Ah 结构域I 和结构域II、Cry1Ab 结构域III，引物Cry1AhF 和AhAhAbR 用于扩增Cry1Ah 结构域I 和结构域II，引物AhAhAbF 和Cry1AbR 用于扩增Cry1Ab 结构域III，表达载体是pET21b。杂合蛋白载体构建引物序列，见表 2。

表 2 杂合蛋白载体构建引物序列

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方向正确的重组质粒转入表达菌株Rosetta（DE3），进行IPTG 诱导表达，诱导表达条件见参考文献^[8]。在20 mmol/LTris·Cl（pH8.0） 缓冲液中进行细胞破碎，然后可溶组分和不可溶组份分别进行SDS-PAGE 分析，蛋白电泳样品制备与SDS-PAGE 分析方法参见文献^[9]。蛋白定量后进行活性测定，棉铃虫、亚洲玉米螟、小菜蛾、甜菜夜蛾的生物测定方法参照文献^{[10, 11, 12]}。此外，利用Image-J 软件包对照片中试虫的身长进行测定，比较发育情况。

通过NCBI 保守结构与数据库（Conserved domain database，CDD）进行比对分析发现，Cry1Ah1 蛋白的结构域I、结构域II、结构域III 分别位于第57-275 位、第280-481 位、第491-629位氨基酸。分别将Cry1Ah1 全长蛋白、3 个结构域核心活性区及3 个独立结构域与Cry1Ab、Cry1Ac进行比较发现，Cry1Ah1 的Endotoxin_N 结构域与Cry1Ab、Cry1Ac 不同，而Cry1Ab 的Endotoxin_C 与Cry1Ac、Cry1Ah 差异较大，3 个蛋白的Endotoxin_M一致性大于98%（表 3）。

表 3 Cry1Ah1 与Cry1Ab13、Cry1Ac1 序列比较/%

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由于Cry1Ah1 与Cry1Ab13 除结构域I 差异外，两者结构域III 还存在较大差异，因此可以通过构建Cry1Ah1 与Cry1Ab13 杂合蛋白来分析Cry1Ah1结构域I 对Cry1A 杀虫蛋白活性的影响。利用SWISS-MODEL 自动建模功能分别获得了Cry1Ah1与Cry1Ab13 结构域I 以及3 个结构域核心活性区的结构信息（图 1），通过分子叠合比对发现，尽管Cry1Ah1 与Cry1Ab13 序列存在较大差异（31%），但是两者结构域I 的碳骨架没有差异（图 1）。进一步分析了结构域I 的表面结构与表面静电势分布，结果显示尽管两个蛋白结构域I 的碳骨架没有差异，由于氨基酸序列以及氨基酸侧链基团不同，两个蛋白的结构表面以及电势分布都有所不同（图 2）。

图 1 Cry1Ah1 与Cry1Ab13 结构域I 碳骨架及二级结构比较

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图 2 Cry1Ah1 与Cry1Ab13 结构域I 表面结构以及静电势分布比较

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由于Cry1Ah1 与Cry1Ab13 结构域I、结构域II、结构域III 的氨基酸序列一致性分别为69%、98%和42%，进一步构建了AhAhAb 杂合蛋白。图 3 显示，杂合蛋白AhAhAb 含有了源于Cry1Ah1 的结构域I、结构域II，源于Cry1Ab13 结构域III ；进一步将构建好的重组质粒转化BL21 Rosetta（DE3）进行诱导表达，结果（图 4）显示AhAhAb 细胞不可溶组分明显出现约76 kD 的目标蛋白条带，而可溶组分中未检测到目标蛋白条带。

图 3 杂合蛋白的示意图

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图 4 杂合蛋白表达产物的SDS-PAGE 分析

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对AhAhAb 蛋白进行了小菜蛾、玉米螟、棉铃虫、甜菜夜蛾的杀虫活性测定，结果（图 5）显示，杂合蛋白AhAhAb 对棉铃虫在100 ppm 时无发育抑制或致死活性；在高浓度（100 ppm）时对甜菜夜蛾有发育抑制活性，处理组存活的试虫平均体长为对照组的79% ；对小菜蛾活性较低，LC₅₀ 为10.99 ppm，95% 置信区间为（4.57-23.38）；对玉米螟的活性较低，LC₅₀ 为13.66 ppm，95% 置信区间为（8.51-27.40），并且主要活性表现为发育抑制，在蛋白浓度为10.00ppm 时，只有7% 的试虫有较好的发育。

图 5 AhAhAb 蛋白对甜菜夜蛾发育抑制活性

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Bt 不仅可以杀灭多种农业害虫，而且其杀虫活性具有高度的特异性，对非靶标生物安全无害。Bt这种高度特异的杀虫活性主要由其编码的Cry 蛋白决定的，因此研究Cry 蛋白杀虫特异性及其进化规律对Cry 蛋白改良与应用有重要意义。本研究针对鳞翅目害虫高效的Cry1Ab13 与Cry1Ah1 开展研究，分析杂合蛋白的杀虫谱，对理解Cry1A 蛋白杀虫特异性的进化有重要意义。

为了研究Cry 蛋白杀虫机制，目前已有多个杀虫蛋白（Cry1^[13]、Cry2^[14]、Cry3^[15]、Cry4^[16] 以及Cry8^[17]）的三维结构通过X 射线晶体衍射的方法被解析出来，它们的结构非常相似，都有3 个结构域。本研究利用同源建模的方法分析Cry1Ab13 与Cry1Ah1 的结构域I 发现，两者具有相同的碳骨架，但是蛋白表面结构和电荷分布都有所不同，这可以为进一步分析杂合蛋白活性变化的原因提供结构信息依据。

对目前已经明确杀虫活性蛋白的各结构域进行序列比对聚类发现，部分杀虫活性多样性（特别是 Cry 类蛋白）可以由结构域III 的重组获得，Cry毒素结构域交换是一种新的杀虫特异性进化的机制。例如：Cry1Ca 和Cry1Cb 以及Cry1Ea 和Cry1Eb等蛋白的结构域I 和II 非常相似，而序列分析发现Cry1Ca 和Cry1Ea 的结构域III 有共同的起源，Cry1Cb 和Cry1Eb 结构域III 也由相同的序列变异而来，与Cry1Be 的结构域III 极为相似。进一步的人工杂合蛋白构建的研究也支持这一结论，一些Cry1蛋白（如Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ba 和Cry1Ea）对甜菜夜蛾低或无活性，当它们的结构域III 被Cry1Ca取代后，则变得具有活性^[18]。此外，进一步的研究认为，结构域I 交换会引起杀虫蛋白在靶标害虫中肠道细胞形成孔洞大小的不同，不会影响蛋白的杀虫特异性^[19]。本研究涉及的Cry1Ac、Cry1Ab 与Cry1Ah 蛋白之间也存在结构域交换的情况（Cry1Ab、Cry1Ac 有相似的结构域I 和II、不同的结构域III ；Cry1Ac、Cry1Ah 有相似的结构域II 和III、不同的结构域I），这些变化没有影响蛋白对主要农业害虫小菜蛾、玉米螟、棉铃虫的杀虫谱^[20]。本研究构建的杂合蛋白AhAhAb 与Cry1Ab 相比，有相似的结构域II 和III、不同的结构域I，杀虫活性测定结果显示，杂合蛋白丧失了对棉铃虫的杀虫活性，改变了对玉米螟活性类型。然而，Cry1Ac 与Cry1Ah 之间同样有相似的结构域II 和III、不同的结构域I，但是两者在这3 种试虫的杀虫谱上却没有差异，只是活性强度略有不同。这些数据显示，3D Cry 蛋白杀虫特异性不仅可能与结构域II、结构域III 有关，还有可能与包括结构域I 在内的3 个结构域的组合有关。本研究数据显示，尽管Cry1Ah 结构域I 碳骨架和二级结构其他Cry1A 蛋白一致，然而由于氨基酸序列的差异，结构域I 的表面基团及电势分布有较大差异^[21]。3D Cry 蛋白中3 个结构域两两之间都有接触，包括结构域I 在内的不同的结构域组合都会影响蛋白结构表面微环境的变化，这些变化可能会对Cry 蛋白的性质产生影响。进一步分析杂合蛋白AhAhAb 与Cry1Ab、Cry1Ah 之间杀虫活性变化的原因对进一步揭示Cry1A 类蛋白杀虫特异性进化规律有重要意义。

本研究针对鳞翅目害虫具有高活性的Cry1A 类蛋白开展研究，构建了Cry1Ab、Cry1Ah 的杂合蛋白AhAhAb 并测定了杀虫谱，结果显示Cry1Ab，Cry1Ah 的结构域交换引起蛋白杀虫谱的显著变化。