1972 年，Gery 等从人白细胞的培养上清中提取得到一种可溶性物质，起初被命名为淋巴细胞激活因子或内源性热原质、破骨细胞刺激因子、黑素瘤细胞生长抑制因子等，在1979 年被统一命名为白细胞介素-1(IL-1)^[1]。IL-1 按其结构不同分为IL-1α和IL-1β。IL-1α 基因定位于2 号染色体，含7 个外显子，IL-1α 的前体是由IL-1α 基因合成的、无信号肽的31 kD 分子。IL-1α 前体被Ca²⁺ 依赖的钙蛋白激酶降解为17 kD 的成熟体，等电点为5.3，IL-1β是由153 个氨基酸以β- 折叠的形式组成位于2 号染色体，分子量约为17.5 kD，等电点为7.2。IL-1α和β 在同一种属中两者的同源性只有20%-30%，但在不同种属间具有较高同源性，分别为60%-70%和75%-78%^{[2, 3]}。IL-1α 具有很重要的研究意义和应用价值，文献报道IL-1α 在白血病、肝癌、黑色素瘤、胃癌等在内的多种肿瘤中均有表达^{[4, 5, 6]}，而其表达机制尚不清楚。临床试验表明，50 ng/kgIL-1α 可治疗骨髓或干细胞移植期间早期血小板的减少^{[7, 8]}。头颈部临床试验III 期发现，IL-1α 具有重要的免疫治疗作用(Cel-Sci Corp)。

目前，IL-1α 主要通过原核表达系统^[9]制备，而真核表达系统尚未见报道。由于原核表达体系存在产量低，操作复杂，后期复性困难等问题。为得到表达量高、活性高的IL-1α，更好地研究IL-1α 的特性和功能，本研究利用巴斯德毕赤酵母表达hIL-1α，在1 L 摇瓶规模下对其进行表达条件优化和分离纯化方法探索，同时，对hIL-1α 的活性进行了初步研究。

E.coli DH5α 购自武汉晶赛生物工程技术有限公司，毕赤酵母X-33 菌株和pPICZαA 分泌型酵母表达载体购自Invitrogen 公司，重组人白细胞介素-1α基因委托上海生工生物工程有限公司合成，兔多抗人IL-1α 抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自Invitrogen 公司，人肝癌细胞(Bel-7402)购自中科院上海细胞库，RPIM1640 培养基购自Invitrogen 公司，胎牛血清购自杭州天杭生物科技有限公司，MTT、DMSO 购自Geneview 公司，限制性内切酶SacI、BamHI和EcoRI等购自MBI 公司，Protein Ladder 购自北京康为世纪生物科技有限公司，考马斯亮蓝G-250(分析纯)购自中国医药公司，牛血清白蛋白(生化试剂)购自西安沃尔森生物技术有限公司，其他试剂为国产分析纯。

在GenBank 上搜索得到IL-1α 基因的全序列(NM_000575)，通过查阅文献确定IL-1α 蛋白的成熟序列，利用在线序列优化工具对IL-1α 核苷酸序列进行人工优化(http ：//www.evolvingcode.net)，在不改变氨基酸序列的情况下，密码子替换为高频使用或次高频使用的密码子^[10]。人工合成优化(终止序列调整、密码子优化并提高GC 含量)后的IL-1α基因序列连接至T 载体，进行测序，用EcoRⅠ/Not Ⅰ双酶切IL-1α/pUC-T 及质粒pPICZαA，回收目的基因片段和载体片段进行连接，连接产物转化至DH5α 感受态，经蓝白斑筛选阳性克隆、提取质粒进行PCR 和双酶切鉴定，结果正确后进行测序。以上操作由上海生工生物有限公司完成。

重组表达质粒pPICZαA/hIL-1α 以SacI 线性化，按毕赤酵母表达手册中电转化方法，将重组表达质粒转至毕赤酵母X-33 感受态细胞，将转化的X-33 涂于含100 μg/mL博来霉素(Zeocin)的YPD 平板上，28℃培养3 d至长出菌落，在YPD 平板上随机挑取8 个克隆，扩大培养后提取酵母基因组DNA，以之为模板，PCR鉴定目的基因是否整合到酵母染色体。

随机挑取1 个鉴定正确的菌种接种到10 mL YPG 培养基/50 mL 三角瓶中，于28℃、250 r/min 摇床培养18-24 h，当OD 值达到10 时，取1 mL 菌液，接种到100 mL BMGY 培养基/1 L 三角瓶中，于28℃、280 r/min 继续培养24 h 后，加入终浓度为1%(V/V)的甲醇进行诱导表达，培养条件调整为28℃、200 r/min。每12 h 补加一次甲醇，补加量为发酵液体积的1%(V/V)。分别取诱导24、48、72、96、120、144、168h 的发酵液于12 000 r/min离心15 min，取1 mL 上清进行三氯乙酸(TCA)后，进行15%SDS-PAGE 电泳检测目的蛋白表达。

毕赤酵母是好氧微生物，溶解氧浓度对菌体的生长和产物的表达有很大的影响，溶氧过低会抑制菌体生长，过高则会促246 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9进菌体的新陈代谢加快，加速菌体死亡，造成蛋白过早降解，不利于目的蛋白积累。转速调节是改变发酵过程中溶解氧的重要方式，较高的转速会提高氧的体积系数，增加发酵液中氧的供给，但同时会加剧细胞的死亡速率，降低产物的表达量^[11]。因此，我们设计了以下正交实验研究在1 L 摇瓶条件下rhIL-1α 诱导表达的最佳装液量和转速，参数设置如下：体积设置：100 mL、200 mL、300 mL ；转速设置：100 r/min、200 r/min、300 r/min。以上实验每组设定3 次重复，在诱导最佳时间进行取样，SDSPAGE电泳检测蛋白表达情况，确定诱导表达的最佳体积和转速。

酵母菌生长最适pH 范围为3.0-7.0，pH 过低会影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，过高则会抑制菌体中某些酶的活性^[12]，通过调节初始pH 值来考察pH 对rhIL-1α 表达的影响。本研究设定pH 梯度为：4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。每组设定3 次重复。

一般而言，毕赤酵母的最佳生长温度为28-30℃，当温度升高到32℃时毕赤酵母菌株不能正常生长，温度对毕赤酵母发酵产物的活性、发酵液的物理性质及合成方向等有重要的影响。研究表明，在发酵过程中，诱导表达时的温度低于菌体生长时的温度更加有利于蛋白的表达^[13]。为此本实验对rhIL-1α 温度优化为20℃、23℃、26℃、29℃。

在毕赤酵母诱导表达过程中，甲醇作为诱导剂和碳源双重身份影响目的蛋白的表达，过低或者过高均影响目的蛋白的表达，因此合适的甲醇浓度是提高外源蛋白表达量的又一个关键因素。文献报道^{[14, 15]}，甲醇添加量一般为0.5%-1%。为了研究在1 L 摇瓶条件下诱导表达的最佳甲醇浓度，本实验设置了0.25%、0.5%、0.75%、1% 四个梯度。

取诱导4 d 的发酵液于4℃，4 000 ×g 离心30 min，收集上清进行10 kD超滤浓缩。取蛋白浓缩液进行DEAE 弱阴离子交换层析柱进行纯化。用buffer A(10 mmol/L Na₂HPO₄pH8.0)平衡柱子，样品以1 mL/min 的流速流穿离子交换树脂，然后用buffer B(buffer A 中含有0-500mmol/L NaCl pH8.0)进行梯度洗脱，紫外检测仪监控，收集各洗脱峰，SDS-PAGE 进行检测。

蛋白免疫印迹按Towbin 等方法^[16]进行。rhIL-1α 进行SDS-PAGE 后，将rhIL-1α 转移到PVDF 膜上，用IL-1α 兔多抗一抗室温孵育1 h，TBST 洗涤3 次，再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗室温孵育1 h，TBST洗涤3 次，超敏ECL 底物发光显色，用Typhoon7500 扫描仪和图像定量软件进行定量分析。

以纯的牛血清白蛋白作为标准品，取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 标准品于10 mL 试管中，加水至1 mL，然后加入4 mL 的G-250 溶液，混匀，静止10 min，在595 nm 处测其吸光值制定标准曲线^[17]。取样品溶液0.2 mL，做3 个重复，以水作空白对照，测其吸光值，并计算蛋白浓度。

人肝癌细胞7402(Bel-7402)于含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培养基，37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养，取对数生长期的细胞，于3 000 个/ 孔接种至96 孔板中培养12 h，待细胞贴壁后弃培养基，更换含有不同浓度rhIL-1α(0、5、10、15、20 ng/mL)的培养基，每组设3 个平行孔。继续培养72 h 后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，于培养箱中培养4 h，弃掉培养基，每孔加入DMSO 150 μL，摇动培养板5 min，使细胞内结晶全部溶解，用Biotek reader 酶标仪在490 nm 处测其吸收值，检测rhIL-1α 对Bel-7402 细胞增殖的影响。

用碱裂解法提取hIL-1α 质粒，并分别进行单双酶切和PCR 扩增，1% 的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果(图 1)显示，重组质粒经SacⅠ单酶切后出现一条5 kb左右条带。BamH I 和EcoRⅠ双酶切后出现4 kb 和500 bp 左右的2 条带。用载体通用引物进行PCR 扩增出现一条1 kb 左右的特异性扩增条带，与预期片段大小一致，经上海生工生物公司测序证明其序列正确。

M ：10000 Marker ；1 ：IL-1α/pPICZαA 的PCR ；2 ：IL-1α/pPICZαA 的双酶切； 3 ：IL-1α/pPICZαA 的单酶切；4 ：IL-1α/pPICZαA 的质粒 图 1 rhIL-1α 三种不同表达载体质粒鉴定结果

图选项

重组表达质粒pPICZαA/hIL-1α 转化毕赤酵母菌X-33 后，在YPD 平板上随机挑取8 个克隆扩大培养，提取基因组后进行PCR 扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳分析(图 2-A)，8 个转化子在1 000 bp 位置均出现预期条带，证明hIL-1α 基因已经整合到酵母基因组中。对鉴定正确的重组菌株进行1L 规模摇瓶筛选，取不同时间表达上清进行SDS-PAGE 检测和Westernblot 鉴定，结果(图 2-B)显示，在相对分子质量约17 kD 处出现考马斯染色条带，与hIL-1α 的分子量一致，且在甲醇诱导第4 天表达量最高。经Westernblot 鉴定(图 2-C)，目的条带均有阳性反应，说明rhIL-1α 正确表达。

取X-33/pPICZαA/hIL-1α 菌株进行活化培养，当OD₆₀₀值达到10 时，将菌种分别接种于不同体积BMGY(100、200、300 mL)培养基中，于28℃，280 r/min摇床振荡培养至OD₆₀₀=2-6，分别取3 瓶含100、200、300 mL 培养基的三角瓶放于100 r/min 的摇床培养；剩余6 瓶分别放于200 r/min 和300 r/min摇床培养(表 1)，每隔12 h 添加甲醇至终浓度为1%，诱导4 d，取1 mL 上清进行TCA 处理后，SDSPAGE电泳检测(图 3)发现，随着体积的增大，蛋白表达量降低，当转速为200 r/min 时，蛋白表达量优于100 r/min 和300 r/min。rhIL-1α 发酵培养最佳体积和转速为100 mL/L，200 r/min。

分别取1 mL 菌液，接种到pH 为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 的BMGY 培养基进行培养，SDS-PAGE 检测(图 4)表明，当pH ＜5.5 时，随着pH 的降低，蛋白的表达量逐渐下降，当pH > 5.5 时，随着pH 的增大，蛋白的表达量显著降低，在pH5.5 时，rhIL-1α 的表达量最高。

(A)PCR 鉴定，M ：3000marker，1-8 ：随机挑取8 个克隆；(B)SDS-PAGE，M ：蛋白marker，X-33 ：空载，1-7 ：24、48、72、96、120、144、168 hrhIL-1α 表达量；(C)Western blot 鉴定，Control ：阳性对照(大鼠肝组织)，X-33 ：空载，1，2 ：rhIL-1α 图 2 rhIL-1α 鉴定结果

图选项

表 1 培养基体积和转速对rhIL-1α 表达的影响

表选项

X-33 ：对照；1 ：培养基100 mL，100 r/min ；2 ：100 mL，200 r/min ；3 ：100mL，300 r/min ；4 ：200 mL，100 r/min ；5 ：200 mL，200 r/min，6 ：200 mL，300 r/min，7：300 mL，100 r/min，8：300 mL，200 r/min，9：300 mL，300 r/min 图 3 培养基体积和转速对rhIL-1α 表达的影响

图选项

图 4 不同pH 对rhIL-1α 的影响

图选项

rhIL-1α 培养进入诱导阶段时，培养温度分别更改为20、23、26、29℃，诱导96 h 后，取发酵液进行SDS-PAGE 检测，结果(图 5)表明，当温度为29℃时，重组蛋白的表达量最低，当温度为26℃时，rhIL-1α 表达量最高。

图 5 不同温度对rhIL-1α 的表达影响

图选项

rhIL-1α 进入诱导期后，在26℃，200 r/min 下培养，甲醇浓度分别设为0.25%、0.5%、0.75%、1.0%，结果如图 6所示，随着甲醇浓度的增加，重组蛋白的表达量随着提高，当添加甲醇浓度为1% 时，rhIL-1α 的产量达到最高。

取诱导4 d 发酵液，经过离心→ 10 kD 膜包浓缩→ DEAE 弱阴离子交换层析方法。收集各洗脱峰，SDS-PAGE 检测发现，在100 mm NaCl 处可以洗脱下单一的目的蛋白(图 7)。蛋白纯度为95%，经Bradford 法测定，蛋白收率为40% 左右。

图 6 不同甲醇浓度对rhIL-1α的影响

图选项

图 7 rhIL-1α 各步分离纯化SDS-PAGE 分析

图选项

不同浓度的rhIL-1α 处理Bel-7402 细胞后，MTT法检测细胞的活力，结果如图 8 所示，10 ng/mLrhIL-1α 处理细胞72 h 后，与对照比有显著的差异(P＜0.05)，当rhIL-1α 的浓度为15、20 ng/mL 时，与对照比有极显著差异(P＜0.01)(图 8)，表明rhIL-1α 对人肝癌细胞7402 具有一定的杀伤力，能抑制癌细胞的增殖生长。

图 8 不同浓度rhIL-1α 对Bel-7402 细胞的影响

图选项

IL-1α 作为重要的促炎性细胞因子参与多种生理活动，如修复、增殖、凋亡、细胞迁移、分化、细胞坏死等，在角膜受损研究中发现，IL-1α 参与到NF-κB 信号通路调控受损角膜的修复^[18]。在非小细胞肺癌的胸腔积液中IL-1α 处于一个高表达水平，它可作为潜在诊断非小细胞肺癌的生物标志物^{[19, 20]}。研究表明，当人永生化角质形成细胞(HaCaT)受中波紫外线(UVB)照射时，细胞分泌大量的IL-1α，IL-1α 下调HaCaT 细胞水通道蛋白3(AQP3)的表达，这一作用可能和皮肤光老化的发生有关^[21]。李树等^[22]的研究发现，在小鼠皮肤受损修复过程中，IL-1α 在受损早期有一次表达高峰，IL-1α 可作为损伤早期时间推断的一个指标。因此，IL-1α 在组织受损、肿瘤、自身免疫性疾病等方面具有重要的潜在临床研究价值。

本实验选用毕赤酵母野生型X-33 菌株，它具有生命力强、无回复突变、分泌能力强、能在YPD和最小规模培养基中生长等优点^[23]。根据酵母在密码子上使用偏爱性，在不改变氨基酸序列的情况下，通过调整终止序列、提高GC 含量对hIL-1α 序列进行优化，把hIL-1α 的成熟肽连在α- 交配因子信号肽的C 端，AOX1 启动子诱导hIL-1α 在毕赤酵母中分泌表达。蛋白产量与发酵条件密切相关，为此，本实验分别从装液量、转速、温度、pH、甲醇浓度5 个方面对rhIL-1α 的发酵条件进行优化。研究表明，装液量和转速直接影响培养基中溶解氧的浓度，在发酵过程中，溶解氧浓度对外源蛋白的表达具有十分重要的影响，过高或过低都不利于蛋白的表达^{[24, 25]}。实验结果显示，在装液量为100 mL/1 L，转速200 r/min 时，蛋白表达量最高，过多的装液量和过高的转速均不利于蛋白的表达。也有研究表明，适当的升高温度，有利于细胞的生长代谢和蛋白的表达，但温度过高会使菌体提早衰老，降低蛋白的表达量^[26]。本实验从20-29℃对rhIL-1α 的表达进行研究发现，随着温度的升高，蛋白产量增加，当温度> 26℃时，蛋白产量随着下降。因此，在诱导阶段适当的降低温度可以减少菌体的死亡，同时也可保护蛋白不被降解^[27]。pH 是影响蛋白表达的又一关键参数，适宜的pH 不仅有利于蛋白的表达，同时也可防止蛋白酶降解，易于后续的纯化工作。结果表明，pH 为5.5 时，最有利于rhIL-1α 的表达。在发酵过程中，定时定量地补加甲醇对蛋白的表达具有至关重要的影响^{[14, 25]}。过低不够蛋白的表达，过高则会导致菌体死亡，降低蛋白产量。本研究发现，随着甲醇浓度的升高，蛋白产量随着增加，在1%时产量达到最多。

本研究用毕赤酵母表达hIL-1α，仅用一步层析纯化，获得纯度高达95% 以上的重组蛋白。与原核表达体系相比，减少了破壁、复性等复杂的纯化步骤，提高蛋白的收率，降低了生产成本。对纯化后的rhIL-1α 进行活性检测发现，rhIL-1α 能抑制Bel-7402 细胞的增殖，与文献报道一致^{[21, 28, 29]}。本研究为深入探讨IL-1α 功能机理提供了良好的条件，同时也为其产业化生产奠定了坚实的基础。

成功构建了rhIL-1α 的毕赤酵母表达体系，对其摇瓶发酵条件进行了优化，最适的发酵条件为装液量为100 mL/1 L 摇瓶、初始pH 为5.5、诱导转速200 r/min，诱导温度为26℃，甲醇添加量为1%，每12 h 补加一次，诱导4 d，最终获得rhIL-1α 的最高产量约30 mg/L，较优化前提高了47.9%。用DEAE弱阴离子交换层析一步法对其进行纯化，得到纯度高达95%，得率约40%，能抑制Bel-7402 细胞增殖的rhIL-1α。