近年来，我国的水产养殖业得到了迅速发展，殖规模不断扩大。由于养殖动物的残饵、排泄物死亡残体等对近岸海水的污染，使养殖水域生态境遭到破坏，直接危害了养殖对象，是暴发性病频繁发生的重要原因，给整个水产养殖业造成了大的经济损失，制约了水产养殖业的发展^{[1, 2, 3, 4, 5]}。前，为了防止病害发生，人们大量使用抗生素和学药物，但只能暂时抑制病害的发生，抗生素杀死或抑制了敏感细菌而保留了耐药性的细菌^{[6, 7]}，坏和干扰了养殖环境中自然微生物生态系统的平及养殖动物的微生态平衡^{[8, 9]}，反而增加了养殖物感染病菌的机会。抗生素在养殖动物体内的残影响了养殖产品的质量，在环境中的残留会造成境污染并最终对人类造成危害^[10]。

过在养殖水体及饵料中加入有益微生物Probiotics）来调节和改善养殖海水生态环境及养殖物微生态环境，提高养殖动物的免疫力，抑制病微生物来控制和减少养殖动物病害的发生，是解水产养殖病害问题的根本途径^[11]。

研究从海洋环境中分离细菌，从中筛选出对殖鱼类病原菌鳗弧菌W-1 有抑制作用的拮抗菌，对抑菌作用较强的菌株WTD 的抑菌条件和药物敏性进行研究，旨在为今后在水产养殖中的应用提参考。

鳗弧菌（Vibrio anguillarum）W-1株由本实验室分离于患病的日本花鲈（Lateolabraxaponicus）鱼苗。

2216E 海洋培养基：蛋白胨5 g，酵粉1 g，磷酸铁0.01 g，琼脂粉20 g，陈海水1 000L，pH 调节至7.6。高铁碳水化合物培养基：每1培养基中含有酵母膏10 g，蛋白胨5 g，可溶性淀20 g，琼脂粉30 g，磷酸铁5 g，pH 调节至7.6。

用无菌采样瓶采取样水样、样和砂样，样品来自青岛沿海海滨及养殖场、厦和石岛沿海。取水样和泥样用灭菌生理盐水作10系列稀释；无菌操作涂布2216E 海洋琼脂平板，28℃温箱培养2-7 d，取平板上的优势菌落进行板划线纯化，获得的菌种置于-80℃冰箱保藏。

将海水养殖鱼类病原菌敏感菌）鲈鱼致病鳗弧菌W-1 在28℃培养24 h，2216E 海洋琼脂平板上划直线，划线后马上将待实验菌株与敏感菌株垂直相交划线，在28℃培养-2 d，观察有无抑菌区，有抑菌现象的为拮抗细菌。

将海水养殖鱼类病原菌（敏菌）鲈鱼致病鳗弧菌在28℃培养24 h，用灭菌生盐水将斜面上的菌液洗下，用血球计数板将菌悬浓度调至106 Cell/mL 的数量级，取0.1 mL 菌液涂于2216E 海洋琼脂平板上，将待筛菌株在此平板点种或划线，在28℃培养2-4 d，观察有无抑菌圈，抑菌圈的为拮抗细菌。

根据《常见细菌系统鉴手册》中的实验方法，对菌株形态及理化特性进鉴定^[12]。利用分子生物学方法对细菌的16S rDNA行提取与测序。抽取细菌DNA 所用的试剂盒为海生工生物工程技术服务公司生产的细菌基因组NA 抽提试剂盒（UNIQ-10 柱式），具体方法参见明书。PCR 扩增16S rDNA 基因采用通用引物，正引物为：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ；反向物为：5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3'。PCR 反体系为：TaKaRa Taq（5 U/μL）0.25 μL，10×PCRuffer（Mg²⁺ Free）5 μL，MgCl₂（25 mmol/L）3 μL，NTP Mixture（ 各2.5 mmol/L）4 μL，模板DNA 1L，两种引物各1 μL，双蒸水34.75 μL。PCR 反应件为：96℃ 5 min，94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ min，30 个循环；72℃ 5 min，-20℃保存。所得到样品序列送由上海生工生物工程技术服务有限公进行测序，利用NCBI 进行blast 分析，同现有细序列作比对。所用测序仪器为ABI-PRISM3730，序试剂为BigDyeterminator v3.1。利用Mega5.2 软绘制系统进化树，确定菌株的系统进化地位。

制备pH 值别为6、7、8 和9 的海洋琼脂平板，分别取0.1L 敏感菌W-1 菌液（10⁶ Cell/mL）涂布于各种pH2216E 海洋琼脂斜面上，将实验菌株在此平板上种，在28℃培养2-4 d，观察抑菌圈大小，以抑圈直径与菌落直径比作为抑菌能力强弱标准。

取0.1 mL感菌W-1 菌液（10⁶ Cell/mL）涂布于2216E 海洋脂平板上，将实验菌株在此平板上点种，分别在5℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃培养2-4 d，察抑菌圈大小，以抑菌圈直径与菌落直径比作为菌能力强弱标准。

制备盐度别为0%NaCl、1%NaCl、2%NaCl、3%NaCl、4%aCl、5%NaCl 和6%NaCl 的2216E 海洋琼脂平板，别取0.1 mL 敏感菌W-1 菌液（10⁶ Cell/mL）涂布各种盐度的2216E 海洋琼脂平板上，将实验菌株此平板上点种，在28℃培养2-4 d，观察抑菌圈小，以抑菌圈直径与菌落直径比作为抑菌能力强标准。

菌株WTD 的药敏实验方参照文献^[13]的方法进行。将海水养殖鱼类病菌（敏感菌）鲈鱼致病鳗弧菌在28℃培养24 h，灭菌生理盐水将斜面上的菌液洗下，用血球计数将菌悬液浓度调至10⁶ Cell/mL 的数量级，取0.1L 菌液涂布于2216E 海洋琼脂平板上，然后将药敏用镊子轻轻夹住放在平板上，倒置在28℃培养相的时间，观察抑菌圈大小，并按照说明书确定是有抑菌效果。

以鳗弧菌W-1 为敏感菌对分离的菌株进行逐一行拮抗实验，共筛选到19 株拮抗菌，其中菌株-B2、1-B1、2-A1、5-C1、5-C2 和5-C3 分离自青石老人海水养殖场的海水，菌株SMD、SMB2-2SN1D 分离自石岛海水，菌株XM5-2、XM8-1 和M9-2 分离自厦门海水，菌株QX、QE、QF 和QQ离自青岛栈桥海泥，菌株CB 分离自青岛近海海水，株WTE 和WTD 分离自青岛第二海水浴场的海水。细菌采集的地点及分离得到的拮抗菌数目来看，以得出在海水养殖场中拮抗菌的数目最多，其中株5-C3、XM5-2、XM9-2 和WTD 拮抗能力比较强，菌株WTD 的拮抗抑菌能力最强，作为进一步研究菌株（表 1）。菌株WTD 对敏感菌W-1 在2216E洋琼脂培养基平板上的抑菌效果，见图 1 和图 2。

表 1 拮抗菌菌株来源及对敏感鳗弧菌w-1 的抗菌效果

表选项

图 1 拮抗菌菌株WTD 抑制敏感菌株W-1 生长的抑菌圈照片（平板点种法，点种的菌为WTD）

图选项

图 2 拮抗菌菌株WTD 抑制敏感菌株W-1 生长的抑菌圈照片（十字交叉划线法，横线为W-1）

图选项

菌株在2216E 海琼脂平板上培养24 h 后，菌体呈长杆状，Gram 染为阳性，染色均匀，有鞭毛，鞭毛周生，具运动性，性好氧，可形成内生芽孢，芽孢椭圆形，不膨大，于菌体中央。菌落圆形，白色，不透明，边缘不整齐，2216E 海洋琼脂培养基上不产生色素，在含高铁碳水化合物培养基中可以产生普切明红色色素。

细菌TD 的部分生理生化反应结果（表 2）表明，菌株TD 不发光、发酵葡萄糖产气、产生吲哚、柠檬酸盐利用阴性、V. P. 反应阳性、甲基红反应阴性、硫化氢产生阳性，过氧化氢酶、氧化酶、淀粉酶阳性、胶酶弱阳性，苯丙氨酸脱氢酶、藻胶酶阴性、卵脂酶、酪蛋白酶、脲酶阳性，O/F 反应葡萄糖为化型，D-半乳糖、麦芽糖、乳糖、鼠李糖、棉籽糖、糖和D-蕈糖为F 型。

表 2 菌株WTD 的部分生理生化反应特征

表选项

菌株WTD 的6S rDNA 序列经过测定后提交至GenBank 数据库，录号是HM146083，利用NCBI 的Blast 程序与数库中的16S rDNA 序列进行比对，确定为芽孢杆属细菌。其中与其拟合度为96% 以上的细菌种类枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）拟合度99%，解粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens） 拟合度99%，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis） 拟合97%，短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）拟合度6%。利用Mega.5.2 软件进行分析，基于Neibour-oining 法构建进化树（对于序列中的空缺部分，采完全删除的方法处理）。结果（图 3）显示，细菌TD 株与解淀粉芽孢杆菌的亲缘关系较近。

图 3 基于16S rRNA 基因的进化分析 图中圆点表示的为本文中的WTD 菌株

图选项

由16S rDNA 的分析、形态及理生化反应实验结果，可以得出WTD 属于芽孢杆属，可能属于枯草芽孢杆菌或者是解淀粉酶芽孢菌，但是根据伯杰氏手册第8 版，枯草芽孢杆菌不产生卵磷脂酶，所以WTD 属于解淀粉酶芽孢杆菌。

不同pH 条件下TD 对敏感菌株W-1 的拮抗作用（图 4）显示，在H 值为7 时菌株的抑菌作用最大，并随着pH 值得高或降低，抑菌作用减小。

图 4 不同pH 条件下菌株WTD 拮抗效果

图选项

不同盐度下TD 对敏感菌株W-1 拮抗作用（图 5）显示，在盐为1%NaCl 的时候拮抗效果最好，随着盐度减小者增大，拮抗效果均减弱。

图 5 不同盐度条件下菌株WTD 的拮抗效果

图选项

不同温度下TD 对敏感菌株W-1 拮抗作用（图 6）显示，在温为35℃的时候拮抗效果最好，随着温度的上升和降，拮抗效果均下降。而在温度为15℃和20℃的候，鳗弧菌W-1 和菌株WTD 均生长良好，没有抗效果。

图 6 不同温度下菌株WTD 的拮抗效果

图选项

拮抗菌WTD 的药敏实验结果（表 3）显示，菌WTD 对麦迪霉素、氟哌酸、奥复星、丙氟哌酸、古霉素、复方新诺明、痢特灵、氯霉素、氯洁霉素、菌必治、先锋必素、丁胺卡那霉素、庆大霉素、那霉素、新霉素、复达欣、强力霉素、美满霉素、霉素、青霉素、苯唑青霉素、氨苄青霉素、氧哌青霉素、羧苄青霉素、先锋霉素、先锋霉素V、锋霉素VI、头孢肤肟和四环素敏感，而对多黏菌具有抗性。

表 3 拮抗菌WTD 的药敏试验结果

表选项

分离的所有拮抗菌中，菌株1-B2、1-B1、2-A1、-C1、5-C2 和5-C3 是采自青岛石老人养殖场的海水本，菌株SMD、SMB2-2 和SN1D 采自石岛样本，株XM5-2、XM8-1 和XM9-2 来自厦门海水样，菌QX、QE、QF 和QQ 取自青岛栈桥泥样，菌株CB自青岛近海水样，菌株WTE、WTD 取自青岛第二水浴场的水样。从细菌采集的地点及分离得到的抗菌数目来看，可以得出在海水养殖场中拮抗菌数目最多，这可能与养殖场病原细菌数目较多有。其中SN1D 鉴定为芽孢杆菌属，WTD、XM9-25-C3 均被鉴定为解淀粉酶芽孢杆菌，但是从及生生化反应上三者均存在着差异，可能是菌株本身在差异。

对解淀粉芽孢杆菌的报道多见于对真菌的抑制，英国等^[14]从堆肥中分离到一株解淀粉酶芽孢杆，可以产生抗菌多肽类物质抑制尖孢镰刀菌、草蛇病菌、毛霉和黑曲霉等多种真菌。郝建安等^[15]现解淀粉芽孢杆菌的抗真菌物质是一种蛋白质分，抑真菌作用是在孢子萌发阶段使真菌新生菌丝形。王德培等^[16]从青贮玉米秸秆饲料中分离得一株解淀粉芽孢杆菌BI2，该菌主要抑制丝状真，对细菌无抑制作用，其培养36 h 的上清液能明显抑制黄曲霉孢子萌发及菌丝生长。段春华等^[17]核桃林地土壤中分离得到一株拮抗解淀粉芽孢杆SDF-005，该菌对5 种植物炭疽病菌丝生长均具较强的抑制作用，其代谢产物可以破坏病原菌菌壁结构，引起菌丝膨大、畸变、扭曲、菌丝壁消。冯金龙等^[18]对解淀粉芽孢杆菌S27 的生物学能进行了研究，结果表明该菌对马铃薯枯萎病菌Fusarium tricinctum）、马铃薯丝核病菌（Rhizoctoniaolani）和马铃薯炭疽病菌（Colletotrichum coccodes）有良好的抑制作用，可致菌丝膨大，断裂及溶解等。实验检测本研究分离的解淀粉芽孢杆菌WTD 菌株对青霉和曲霉的生长无抑制作用，需要进一步的实确定其对病原真菌有无抑制作用。

利用拮抗微生物抑制水体中病原微生物的生，使病原菌的浓度低于其致病浓度，进行水产养病害的防治，是国内外水产养殖病害控制的热^{[19, 20, 21, 22]}。曹海鹏等^[19]从养殖池污泥中分离筛选一株解淀粉芽孢杆菌G1，该菌表现出了对鲟源原性嗜水气单胞菌的良好拮抗作用，其最适生长H 为7，最适生长温度为30℃，与本研究报道菌株TD 生长条件相近。本实验采用平板点种法从分离株中筛选对病原菌鳗弧菌W-1 的拮抗菌，即将待菌株直接点种到涂有病原菌的平板上，此方法不可以直接观察到拮抗菌通过分泌拮抗物质产生的菌区，还可通过抑菌圈的大小，定量比较拮抗菌菌活性的强弱^[21]。在以不同pH、盐度、温度比拮抗菌抑菌活性的强弱时，应当同时考虑不同培条件对病原菌的生长的影响。傅松哲等^[22]从海沉积物中分离到两株拮抗弧菌，短小芽孢杆菌H2地衣芽孢杆菌H4，它们对需钠弧菌的生长都具有著的抑制作用，对凡纳滨对虾的现场实验结果表，加入菌株短小芽孢杆菌H2 可显著提高凡纳滨虾的存活时间。需要对本研究分离的解淀粉芽孢菌菌株WTD 进行模拟养殖实验证明该菌的生物安性。

解淀粉芽孢杆菌可产生抑菌蛋白类、脂肽类生素、大环内酯类、寡肽酶、肽类和聚酮化合物^{[23, 24]}，可抑制病原真菌和细菌的生长，另外，解粉芽孢杆菌是一种对人畜相对安全的细菌，使其望作为益生菌在畜牧水产养殖中得到应用。本研分离的解淀粉芽孢杆菌菌株WTD 对鲈鱼病原菌鳗菌W-1 具有较强的抑制作用，实验中发现其冷冻燥的上清液对鳗弧菌W-1 具有明显的拮抗效果，抗物质在50℃、80℃和100℃处理后依然表现出抗效果，说明该物质对热具有稳定性，同时用蛋酶K 处理后也依旧表现出抑菌活性。说明该抑菌质不是蛋白质类物质，需要对菌株拮抗鳗弧菌物进行进一步的研究才能确定其性质。必须对分离株WTD 的拮抗机理、菌种拮抗条件及菌种安全性验等进一步的研究才有望进入应用阶段。

本研究从青岛、厦门和石岛的海洋环境中分离126 株细菌，从中筛选出19 株对鲈鱼病原菌鳗弧W-1 具有拮抗作用的细菌，其中抑菌作用较强的株WTD 鉴定为解淀粉芽孢杆菌。该菌的最佳抑菌用条件为温度35℃，pH 值为7，盐度为1%NaCl。敏实验结果表明，该菌对麦迪霉素等29 种抗生素感，而对多黏菌素具有抗性。