2. 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江524088 ；
3. 广东省教育厅水产 经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088 ；
4. 仲恺农业工程学院，广州 510225
2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088 ；
3. Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutions，Zhanjiang 524088 ；
4. Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225
1989 年，IL-10 首次在鼠类T 细胞中作为细胞因子合成抑制因子被报道[1]。除T 细胞外，B 细胞、嗜酸性粒细胞、单核巨噬细胞、NK 细胞等，几乎所有淋巴细胞均能合成IL-10[2]。IL-10 主要调控炎症反应，它不仅能通过抑制单核巨噬细胞释放免疫介质、抗原呈递和细胞吞噬作用，抑制CD4+ T 细胞的增殖和细胞因子合成，抑制呼吸爆发等，从而抑制免疫作用；也能通过刺激NK 细胞、CD8+ T 细胞的细胞毒活性增强免疫作用[3, 4, 5, 6]。在哺乳动物研究中表明，IL-10 是以二聚体形式行使其生物学功能，通过与IL-10R1/R2 受体配体复合物结合，使JAKSTAT信号通路上JAK1 和Tyk2 的磷酸化，从而招募和激活转录因子STAT3 等，选择性激活或抑制基因转录，发挥其抗炎生物学功能[7, 8, 9, 10]。除JAK-STAT信号通路，IL-10 还通过其他信号通路介导免疫反应。
目前为止，IL-10 已在河豚、鲤、斑马鱼、黑鲈、鳕鱼、金鱼、虹鳟等硬骨鱼中被发现[11, 12, 13, 14, 15, 16, 17]，其中虹鳟中发现两个同源性92% 的IL-10 剪切体。但对于斜带石斑鱼IL-10 相关的研究还未见相关报道。本实验对斜带石斑鱼IL-10 基因进行克隆及其生物信息学分析，以期为进一步研究该基因的结构特点和免疫调节作用奠定基础；同时构建IL-10 原核表达载体，表达IL-10 融合蛋白，旨在为进一步研究斜带石斑鱼IL-10 蛋白生物学功能提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验用鱼实验用斜带石斑鱼采集自湛江某水产品市场。
1.1.2 载体与菌株克隆载体pMD18-T 质粒和表达载体 pET-32a（+）质粒均购自TaKaRa 公司，大肠杆菌 DH5α 和BL21 菌株来自本实验室保存的菌株。
1.1.3 主要试剂UNIQ-10 柱式Trizol 总RNA 提取试剂盒购自上海生工生物技术有限公司；质粒提取试剂盒及DNA 胶回收试剂盒购自Thermo 公司；PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、Ex Taq DNA 聚合酶、限制性核酸内切酶Xho I 和BamH I、T4 DNA 连接酶、末端转移酶TdT、dNTPs、DNA Marker、蛋白Marker等购自TaKaRa 公司；M-MLV 反转录酶购自NEB 公司；用PCR 的引物及序列测定均由上海生工生物技术有限公司完成。
1.2 方法 1.2.1 斜带石斑鱼总RNA 的提取及cDNA 第一链 合成斜带石斑鱼脾脏总RNA 提取按照UNIQ-10柱式Trizol 总RNA 提取试剂盒说明书进行；按照M-MLV 反转录酶说明书以3adapter 为引物合成第一链cDNA，进行同源克隆及3'-RACE ；以5-RECE-D1为引物合成cDNA，按照DNA 胶回收试剂盒说明书对cDNA 进行纯化，纯化后的cDNA 按照末端转移酶TdT 说明书对其加上ployA 尾，产物用于进行5'-RACE。
1.2.2 斜带石斑鱼IL-10 中间片段获得根据GenBank 上已登录的舌齿鲈Dicentrarchus labrax（DQ821114.1）和鲫Carassius auratus（HQ259106.1）设计简并引物IL-10-F1 和IL-10-D1，同源克隆获得IL-10 的基因片段。
1.2.3 斜带石斑鱼IL-10 基因3'-RACE根据获得的中间片段设计3'-RACE 特异引物（3-RACE-F1 ；3-RACE-F2）。3'-RACE 反应体系：第一轮PCR ：cDNA 2.5 μL，3-RACE-F1（10 μmol/L）1 μL，long（0.4 μmol/L）/short（2 μmol/L）2 μL，PrimeSTARHS DNA 聚合酶0.25 μL，5×PrimeSTAR Buffer 5 μL，dNTP mix（2.5 mmol/L）2.5 μL，加水补足25 μL。PCR 反应条件：94℃ 30 s，66℃ 45 s，72℃ 2 min，5 个循环；94℃ 30 s，60℃ 45 s，72℃ 2 min，25 个循环，共计30 个循环。第二轮PCR ：首轮PCR 产物稀释20 倍1 μL，3anchor 1 μL，3-RACE-F2（10μmol/L）1 μL，Ex Taq DNA 聚合酶0.25 μL，10×ExTaq Buffer 2.5 μL，dNTP mix（2.5 mmol/L）2.5 μL，加水补足25 μL。反应条件同第一轮PCR。
1.2.4 斜带石斑鱼IL-10 基因5'-RACE根据获得的中间片段设计5'-RACE 特异引物（5-RECE-D1 ；5-RACE-D2 ；5-RACE-D3）。5'-RACE 反应体系：第一轮PCR ：加尾产物 2.5 μL，5-RACE-D2（10μmol/L）1 μL，5oligodT-anchor 1 μL，Ex Taq DNA 聚合酶0.25 μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP mix（2.5mmol/L）2.5 μL，加水补足25 μL。PCR 反应条件：94℃ 30 s，61℃ 45 s，72℃ 1 min，5 个循环；94℃30 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，5 个循环；94℃ 30 s，56℃ 45 s，72℃ 1 min，18 个循环，共计28 个循环。第二轮PCR ：首轮PCR 产物稀释25 倍 1 μL，5anchor 1 μL，5-RACE-D3（10 μmol/L）1 μL，Ex TaqDNA 聚合酶0.25 μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTPmix（2.5 mmol/L）2.5 μL，加水补足25 μL。反应条件同第一轮PCR。本实验所用引物序列，见表 1。
利用NCBI 在线软件ORF finder（http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）确定开放阅读框（ORF）及蛋白氨基酸序列；运用ExPASy ProtParam（http ：//web.expasy.org/protparam/）预测蛋白分子量（Mw）和理论等电点（pI）；采用SignalP 4.1 Server（http ：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 预测对信号肽进行预测；通过TMHMM Server v.2.0（http ：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析是否存在跨膜结构域；功能位点分析使用ExPASy PROSITE 在线软件（http：//prosite.expasy.org/）；蛋白结构预测采用PredictProtein（https ：//www.predictprotein.org/）、Phyre 2 server（http ：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/ html/page.cgi?id=index） 和SWISS Model（http ：//swissmodel.expasy.org/）；用DNAMAN6.0 软件对斜带石斑鱼IL-10氨基酸序列与其他物种IL-10 进行同源比对分析及序列拼接；利用MEGA6 软件进行系统进化树的构建。
1.2.6 斜带石斑鱼IL-10 原核表达载体pET-32a-IL10构建及其原核表达条件的优化根据已得到的IL-10基因cDNA 全长设计含酶切位点的引物扩增IL-10 去信号肽核心片段，引物为IL10F（BamH I）及IL10R（Xho I）。将用Ex Taq 酶PCR 扩增获得的含酶切位点的基因片段连接到pMD18-T 载体，对测序正确的阳性克隆和pET-32a（+）载体进行用BamH I 和XhoI 双酶切，1.5% 琼脂糖电泳后回收相应的目的条带，用T4 DNA 连接酶进行连接后转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，对阳性克隆进行测序。用终浓度为0.1 mmol/L IPTG 诱导4 h 进行原核表达。融合蛋白表达的优化按黄瑜等[18]的方法进行。
2 结果 2.1 斜带石斑鱼IL-10基因克隆结果（图 1）显示，获得全长1 104 bp 的IL-10基因，ORF 为564 bp，编码187 个氨基酸。GenBank登录号为KJ741852。蛋白理论分子量（Mw）为21.7kD，理论等电点（pI）为5.74，存在一个22 个氨基酸的信号肽，无跨膜区。ExPASy 预测斜带石斑鱼IL-10 蛋白存在4 个蛋白激酶C 磷酸化位点（24、73-75、135-137、177-179），3 个酪蛋白激酶II 磷酸化位点（69-72、85-88、150-153），1 个N 端酰基化位点（146-149）及1 个N 端糖基化位点（156-161）。
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| 图 1 IL-10 cDNA 核苷酸及其编码的氨基酸序列 加粗为起始密码子ATG 和终止密码子TGA ；方框为信号肽；下划线为mRNA 不稳定信号基序 |
多序列比对结果（图 2）显示，斜带石斑鱼IL-10 的氨基酸序列与吉富罗非鱼的同源性较高，为72.25%，而与人和猴的仅有26.18% 和25.13%。在IL-10 多肽链的30、80、110 和116 位存在4 个非常保守的半胱氨酸。运用MEGA6 软件，以N-J 法构建IL-10 的系统进化树，结果（图 3）显示，斜带石斑鱼IL-10 与维多利亚湖慈鲷（P. nyererei）、斑马宫丽鱼（M. zebra）和吉富罗非鱼（O. niloticus）聚为一支。
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| 图 2 IL-10 氨基酸序列的同源性比对 Fig. 2 Maylandia zebra：宫丽斑马鱼（XP_004545126.1）；Epinephelus coioides：斜带石斑鱼（KJ741852）；Oreochromis niloticus：尼罗罗非鱼（XP_003441414.1）；Cynoglossus semilaevis ：半滑舌鳎（XP_008318394.1）；Oncorhynchus mykiss ：虹鳟（NP_001232028.1）；Homo sapiens ：智人（BC104253.1）；Gallus gallus ：原鸡（AJ621254.1）；Rattus norvegicus ：褐家鼠（NM_012854.2）；浅灰色背景为4 个构成二硫键的半胱氨酸，方框为IL-10 特征序列 |
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| 图 3 IL-10 氨基酸的系统进化树 Fig. 3 Pundamilia nyererei ：维多利亚湖慈鲷（XP_005739520.1）；Maylandia zebra ：宫丽斑马鱼（XP_004545126.1）；Oreochromis niloticus ：尼罗罗非鱼（XP_00-3441414.1）；Epinephelus coioides ：斜带石斑鱼（KJ741852）；Stegastes partitus ：深裂眶锯雀鲷（XP_008294254.1）；Cynoglossus semilaevis ：半滑舌鳎（XP_008318394.1）；Xiphophorus maculatus ：花斑剑尾鱼（XP_005804372.1）；Poecilia reticulata ：网纹鳉（XP_008407467）；Dicentrarchus labrax ：舌齿鲈（ABH09454.1）；Oryzias latipes ：青鳉（XP_004069312.1）；Takifugu rubripes ：红鳍东方鲀（XP_003973743.1）；Gadus morhua ：大西洋鳕鱼（ABV64720.1）；Oncorhynchus mykiss ： 虹鳟（NP_001232028.1）；Carassius auratus ： 金鱼（ADU34193.1） |
软件分析显示IL-10 蛋白二级结构中有117 处α-螺旋，占总二级结构的62.57% ；42 处无规则卷曲，占总二级结构的22.46% ；14 处β-转角和14 处共有延伸链，各占总二级结构的7.49%。PredictProtein和SWISS MODEL 的结果（图 4）显示，斜带石斑鱼IL-10 蛋白存在6 个α 螺旋，三维结构以二聚体形式存在，其空间结构与人IL-10 相似。
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| 图 4 预测斜带石斑鱼IL-10（A）与人的IL-10（B）的空 间结构结构比较 |
对测序正确的阳性菌与pET-32a（+）质粒的空载体菌分别在0.1 mmol/L IPTG 的浓度下诱导4 h 进行预诱导，结果（图 5-A）显示分子量为37.5 kD 的融合蛋白在大肠杆菌BL21 中表达。在IPTG 为0.1mmol/L 浓度时，融合蛋白在3 h 后表达量不再增加（图 5-B）；在IPTG 浓度为0.02、0.06、0.1、0.4、0.6及1 mmol/L，诱导4 h 后，蛋白在0.02 mmol/L 和0.6mmol/L 时表达量最大（图 5-C）；在IPTG 浓度为0.1mmol/L 时，温度为16℃、28℃和37℃，诱导4 h 后，37℃时蛋白在沉淀中表达量最大，而28℃时，上清中融合蛋白较多（图 5-D）。
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| 图 5 IL-10 蛋白的原核表达 M ：蛋白质Marker ；A ：1 ：pET-32a（+）未诱导；2 ：pET-32a（+）诱导；3 ：pET-32a-IL10 未诱导；4 ：pET-32a-IL10 诱导。B ：不同时间：0-7 ：分别为0、1、2、3、4、5、6 和7 h。C：不同IPIG 浓度：1-6：分别为0.02、0.06、0.1、0.4、0.6 和1.0 mmol/L。D：不同温度：1，3，5：16℃、28℃、37℃诱导上清；2，4，6 ：16℃、28℃、37℃诱导沉淀 |
本研究成功克隆了全长为1 104 bp 的斜带石斑鱼IL-10 基因，ORF 为564 bp，编码187 个氨基酸，在3' 端非编码区存在2 个mRNA 不稳定基序（ATTTA），表明该基因可能在炎症反应和免疫应答中较为活跃[19]。在斜带石斑鱼IL-10 氨基酸序列中存在LLDESVEESFKSPFGCHAMNSILEFYLNTVL 和GLFKAMGDLDVLFNYIE 两个属于IL-10 特征基序L-[FILMV]-X3-[ILV]-X3-[FILMV]-X5-C-X5-[ILMV]和G-X2-KA-X2-[ED]-X-D-[ILV]-[FLY]-[FILMV]-X2- [ILMV]- [EKQZ]的序列。4 个非常保守的半胱氨酸（Cys-30、Cys-80、Cys-110 和Cys-116）在斜带石斑鱼IL-10 多肽链中被发现，在人和哺乳动物IL-10研究表明，IL-10 存在对蛋白空间结构的形成非常重要的两个二硫键，对蛋白行使生物学功能不可或缺[8, 9]。不同于人和哺乳动物IL-10，斜带石斑鱼IL-10 成熟肽还存在一个额外的半胱氨酸（Cys-26），在其他已报道的鱼类IL-10，如斑马鱼[13]、鲤[12]、虹鳟[17]等，也存在类似的现象，IL-10 通常以二聚体行使生物学功能，这一可能的二硫键形成位点，是否对IL-10 的蛋白具有生物学意义还有待研究。哺乳动物IL-10 通过磷酸化行使其一些生物学功能[20]，在鼠IL-10 发现一个潜在的糖基化位点，但不是蛋白功能所必需的[21]。斜带石斑鱼IL-10 蛋白分析显示其存在4 个蛋白激酶C 磷酸化位点、3 个酪蛋白激酶II 磷酸化位点以及1 个N 端酰基化位点和1 个N 端糖基化位点，这些修饰位点对蛋白功能是否有影响可以通过蛋白点突变来验证。
氨基酸同源性比对显示斜带石斑鱼IL-10 的氨基酸序列与吉富罗非鱼的同源性最高，为72.25%，而与人类和猴的同源性较低。斜带石斑鱼IL-0 蛋白结构预测显示斜带石斑鱼IL-10 含有6 个α 螺旋，以二聚体形式存在于生物体中，与对人和哺乳动物的研究一致。其三级结构与人IL-10 空间结构类似，蛋白的结构与蛋白功能之间的关系非常密切，斜带石斑鱼IL-10 可能和哺乳动物功能相同，以二聚体形式与其受体相结合，通过Jak-Sata 信号通路来实现其对细胞的免疫调控[7, 10, 20]。Grayfer 等[16, 22]基于对金鱼和斑马鱼IL-10 及其受体IL10R 特征和功能的研究，也认为IL-10 的功能在进化上可能高度保守。
本实验成功表达出分子量为37.5 kD 的斜带石斑鱼IL-10 融合蛋白。选择pET-32a（+）质粒构建原核表达载体是因为pET 系列拥有T7 强启动子的载体，能短时间内大量表达目的蛋白，而表达的融合蛋白带有6 个组氨酸标签有利于蛋白后续的分离与纯化，且多数情况下表达的融合蛋白不影响蛋白的免疫原性和免疫反应性。原核表达条件优化显示，在IPTG 浓度为0.02 mmol/L，37℃诱导3 h，蛋白包涵体的表达量最大。这些结果为后续进行IL-10蛋白的富集及抗体的制备奠定基础。而斜带石斑鱼IL-10 融合蛋白在低温诱导时，上清也有明显表达，可以省去包涵体蛋白复性等相关复杂操作，获取活性蛋白。本研究的后续实验将进行IL-10 的分离纯化，参照Grayfera 等[16]的实验操作，研究其对细胞呼吸爆发的影响，以及IL-10 对细胞内一些免疫相关基因表达的调控，探讨IL-10 在石斑鱼免疫反应中的作用与哺乳动物是否类似。
4 结论本研究从斜带石斑鱼成功克隆了IL-10 基因。该基因全长1 104 bp，编码187 个氨基酸，理论分子量为21.7 kD，理论等电点为5.74，同源分析显示与吉富罗非鱼亲缘关系较近。并对斜带石斑鱼IL-10的重组表达和表达条件进行了探索，其优化条件为：0.02 mmol/L 的IPTG，37℃诱导3 h。
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