酰基辅酶A 合成酶（acyl-CoA synthetase，ACS）也称为脂肪酸：CoA 连接酶，一般情况下，ACS 根据其脂肪酸底物的碳链长度而被分为短链ACS、中链ACS、长链ACS 三类[1, 2]。ACS 广泛存在于真核和原核生物中，多含两个高度保守区域：AMP-binding domain 和fatty acid acyl-coA synthetase（FACS） 区。其中FACS 区作为脂肪酸绑定位点，特异存在于中长链ACS 中，对酶催化活性有重要影响[3, 4]。ACS能将细胞内脂肪酸活化成与之对应的辅酶A 硫酯底物，该底物能参与胞内脂肪酸碳链延长、三脂酰甘油合成、蛋白脂酰化、脂肪酸氧化降解等过程[5]。
莱茵衣藻作为微藻研究的模式生物，已被广泛地应用于微藻油脂合成研究[6, 7, 8]，但其酰基辅酶A合成酶crACS 却鲜有报道，在油脂合成与代谢中的功能尚不明确。本研究通过生物信息学方法预测一条莱茵衣藻酰基辅酶A 合成酶基因，对其cDNA 进行克隆，并通过酵母互补实验初步研究其生物学功能，以期为莱茵衣藻油脂合成与分解代谢研究提供依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 藻株和菌株莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii CC849）由本实验室藻种库提供。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae YB525）由中国海洋大学潘克厚教授慷慨提供[9]。
1.1.2 酶及试剂RNA 提取试剂盒TaKaRa RNAiso Plus、反转录试剂盒、酵母基因组提取试剂盒均购于TaKaRa 生物工程（大连）有限公司。引物由上海生物工程有限公司合成。脂肪酸标准品购于上海安普生物科学仪器有限公司。尿嘧啶缺陷型培养基购于北京泛基诺科技有限公司。其他均为常规分子和化学分析纯试剂。
1.2 方法 1.2.1 培养方法莱茵衣藻生长培养基为TAP，培养温度23℃，100 μE/m2/s，持续光照12 h/d ；YB525生长培养基为YPD，筛选培养基为尿嘧啶缺陷型培养基添加2%（W/V）葡萄糖，诱导培养基为尿嘧啶缺陷型培养基添加2% 半乳糖，功能分析培养基为诱导培养基添加不同碳链长度的脂肪酸（分别为C12∶0、C14∶0、C16∶0、C16∶1 和C18∶0，浓度100 μmol/L），培养温度30℃，转速220 r/min。
1.2.2 总RNA 的提取取对数末期CC849 藻液2mL，去上清后用TaKaRa RNAiso Plus 试剂盒提取总RNA，具体步骤参照试剂盒说明书。经Nanodrop ND2000 和琼脂糖凝胶电泳分析，质量合格的RNA置-80℃保存备用。
1.2.3 cDNA 克隆及序列分析取1 μg CC849 总RNA，用TaKaRa 反转录试剂盒，合成cDNA 第1 条链。根据NCBI 数据库中同源物种酰基辅酶A 合成酶序列XM_001702895，设计引物crACSF 和crACSR（表 1），使用GC buffer I、LA-Taq 酶扩增莱茵衣藻酰基辅酶A 合成酶cDNA cracs。PCR 条件为：94℃预变性5 min ；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，35个循环；72℃延伸10 min。PCR 扩增产物切胶回收后连接到pEASY-T1 simple 载体并转化感受态细胞，挑选阳性克隆测序，测序正确的质粒命名为cracs-T。
MEGA6.0 分析基因家族的系统进化树，采用Bootstrap 方法重复1 000 次分析，Neighbor-Joining算法构建进化树。DNAMAN 软件分析cracs 编码蛋白的属性。ClustalW 分析保守序列。
1.2.4 YB525 表达载体构建利用限制性内切酶Kpn I 和 Xho I 分别双酶切质粒pYES2 和cracs-T，酶切产物pYES2 和cracs 回收后进行酶连，转化大肠杆菌，经过PCR、双酶切和测序验证正确的重组载体被命名为pYES2-cracs。
1.2.5 YB525 转化子的筛选及鉴定将重组载体pYES2-cracs 和pYES2 以电转化的方法[10] 转入YB525，30℃培养一周，用筛选培养基筛选转化子。随机选取转化子并培养后提取基因组DNA，以表 1引物VF/VR 对其进行PCR 鉴定和测序分析。pYES2和pYES2-cracs 的酵母阳性转化子分别命名为YPES2和YPACS。
1.2.6 crACS 在YB525 中的表达与功能验证筛选培养基30℃，220 r/min 培养YPES2 和YPACS 至对数中后期，收集100 mL 菌体，2 mol/L 山梨醇洗两次，诱导培养基培养4 h。取100 μL 培养液接种于10 mL功能分析培养基，培养240 h 后测定其OD600 值。
2 结果 2.1 cDNA克隆及序列分析克隆cDNA 序列片段及将其连接到pEASY-T1 simple 载体后的双酶切结果如图 1 所示，测序显示其大小为2 004 bp，与NCBI 数据库登录号为XM_001702895 的序列一致。根据核苷酸序列测定结果和比较基因组学分析，推测出该基因包含16 个外显子，15 个内含子，内含子均以GT 开始并以AG结尾，基本符合内含子的特征。该基因外显子与内含子的分布，见图 2。DNAMAN 分析表明，cracs 编码的蛋白质含有667 个氨基酸残基，推测其分子量为72.3 kD，等电点为6.87。
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| 图 1 莱茵衣藻cracs 的RT-PCR 产物（A）和cracs-T（B）双酶切产物凝胶电泳分析 |
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| 图 2 cracs 基因示意图 |
用Bioedit 软件比对crACS 与拟南芥等9 个物种的10 条ACS 氨基酸序列，结果（图 3）显示crACS存在两段高度保守的区域。保守序列分别为“YTSGTTGDPK”和“DGXXHTGDXGXXXXXGXLK-IIDRKK”，前者为AMP-binding 蛋白家族成员中高度保守的AMP-绑定位点，该序列普遍存在于所有已报道的酰基活化酶超家族成员中，后者恰为脂肪酸的绑定位点FACS 区。这两个保守区基本存在于所有物种的中长链ACS 中。因此，初步推测crACS 为莱茵衣藻酰基辅酶A 合成酶。
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| 图 3 莱茵衣藻crACS 与其他物种的ACS 比对的部分结果 |
基于crACS 与拟南芥、三角褐指藻等9 个物种的23 条ACS 蛋白序列绘制的进化树（图 4）显示，所有的ACS 都起源于同一个祖先。莱茵衣藻crACS 与拟南芥AtLACS1、AtLACS2、AtLACS3、AtLACS4、AtLACS5 及甘蓝型油菜BnLACS 同属一个进化分支，而与拟南芥AtLACS6、AtLACS67、AtLACS68、AtLACS9 聚类于不同的进化分支。进化树还显示crACS 与人、褐家鼠、铜绿假单胞菌的ACS 的亲缘均较远。此外，两个超长链ACSAAC17118.1/ NP_003636 处于进化分枝的最外围，与crACS 的亲缘关系最远，据此推测crACS 不属于超长链ACS。
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| 图 4 莱茵衣藻CC849 crACS 与其他8 个物种22 条ACS 的进化树 |
YPES2、YPACS 基因组PCR 结果（图 5）显示，分别得到约160 bp 和约2 000 bp 的基因片段，测序结果表明PCR 结果与cracs 序列完全一致。
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| 图 5 YB525 转化子YPES2 和YPACS 的鉴定 |
YB525 是ACS 基因部分缺失的酵母，不能以脂肪酸为唯一碳源生长，转入具有ACS 功能的外源基因后可恢复生长。YPES2、YPACS 在YB525 中的功能验证结果（图 6）显示，YPACS 在含有C14∶0 和C16∶1 的功能分析培养基上生长良好，而YPES2在所有的功能分析培养基中基本不生长，表明cracs转入后成功互补了YB525 ACS 基因的缺陷。此外，YPACS 在含有C12∶0、C16∶0 或C18∶0 的功能分析培养基中都不能正常生长，说明crACS 具有底物偏好性。因此，莱茵衣藻crACS 具有酰基辅酶A 合成酶活性。
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| 图 6 培养10 d YPES2 和YPACS 的生长状况 |
ACS 广泛存在于真核和原核生物中，并在脂肪酸代谢过程中起重要作用，越来越多的研究表明，ACS 与脂肪酸碳链延长、三脂酰甘油合成和脂肪酸β-氧化降解等途径紧密相关[5, 12]。目前一些高等植物、细菌和微藻的LACS 家族基因已经被克隆和分析[13, 14, 15, 16]，其中油菜LACS 参与油脂的合成，铜绿假单胞菌LACS 可以催化长链脂肪酸且参与脂肪酸β-氧化反应，假微型海链藻LACS 与DHA、EPA 的代谢关系密切。因此，克隆莱茵衣藻cracs 及分析其编码蛋白的功能，有助于了解莱茵衣藻脂肪酸和油脂代谢调控机制。
莱茵衣藻crACS 进化树比对发现，crACS 与拟南芥AtLACS1-5 在同一个进化分枝，而与AtLACS6-7 处于临近分枝。拟南芥的LACS 家族成员各具不同的功能，其中AtLACS1-3 不仅能利用酵母的脂肪酸还具有脂肪酸转运蛋白酶的功能[11, 17]。Faldua[18]进一步研究表明AtLACS6 和AtLACS7 编码的过氧化酶体ACS 蛋白参与脂肪酸β-氧化。因此，可推测crACS 参与脂肪酸的合成途径。进化树还显示crACS 与进化树中所有的长链ACS 分布于一个大分枝，与进化树中两个超长链ACS（AAC17118.1/NP_003636.2）亲缘关系较远，因此认为crACS 不是超长链酰基辅酶A 合成酶。
微拟球藻的LACS NOLACS 偏好C14∶0、C16∶0、C18∶0 等脂肪酸底物，且优先利用长链脂肪酸[9]。YPES2 和YPACS 的生长状况所示的研究结果与此相似，crACS 偏好利用C16∶1、C14∶0 等长链脂肪酸作为底物，这些长链脂肪酸是莱茵衣藻脂肪酸的主要成分，说明crACS 可能活化莱茵衣藻中的长链脂肪酸并参与其代谢反应。一般同一个物种中存在多个ACS，如拟南芥[11]和三角褐指藻[19]中分别分离鉴定了9 个和5 个ACS。目前本研究仅克隆并初步分析了莱茵衣藻的1 个ACS，未来将进一步研究crACS 的功能并寻找更多的crACS 同工酶，同时将通过基因调控crACS，研究其对脂肪酸合成与代谢的影响。
4 结论本研究运用生物信息学的方法首次从莱茵衣藻中预测并克隆一个酰基辅酶A 合成酶的cDNA 序列，酵母表达实验证实该基因能互补缺陷型酵母YB525，具有酰基辅酶A 合成酶的活性，能活化外源脂肪酸。
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