MicroRNAs (miRNAs)是一类内源基因编码的单链小分子非编码RNA,长度为18-25个核苷酸,其主要通过两种机制调控其靶基因的表达:剪切靶基因mRNA或者抑制靶基因翻译[1, 2, 3]。miRNAs是植物应对生物和非生物逆境中的重要调控因子[4, 5]。miR169是受多种胁迫(如干旱、氮饥饿、高盐、冷害等)条件调控的一个保守miRNA家族[6, 7, 8]。核因子Y (nuclear factor Y,NF-Y)是普遍存在的一类转录因子,由NF-YA、NF-YB和NF-YC三个亚基组成。NF-YA家族含有miR169靶标位点,miR169可以抑制NF-YA基因转录[9, 10]。氮饥饿显著下调拟南芥中miR169的表达水平,上调靶基因NF-YA的表达,从而调控植物中氮素传感器NRT1.1的表达,因此调节了植物应对氮饥饿的反应[7]。高盐胁迫能够诱导拟南芥miR169的表达,其靶基因NF-YA作为CAAT结合因子,进一步参与基因表达调控和信号转导,从而抵抗高盐胁迫[11]。miR169还参与调控植物的花期,过量表达miR169d,抑制了靶基因AtNFYA2,从而减少FLC (Flowering Locus C,FLC)的表达,导致FLC的靶基因FT (FLOWERING LOCUS T)和LFY (LEAFY)表达量增加,从而促进拟南芥开花[12]。干旱胁迫下调拟南芥miR169a和miR169c的表达,共表达实验表明miR169a能更高效地抑制atNFYA5的mRNA水平。nfya5突变体和过表达ath-miR169a的转基因植株加快了叶片的失水速率,对干旱胁迫也更加敏感[9]。共表达实验和5'RACE实验都证明miR169可以剪切菜豆GmNFYA3,将GmNFYA3在拟南芥中过表达,则转基因植株叶片失水速率降低,抗旱性明显增强,而对高盐、ABA则更为敏感[10]。此外,miR169还参与了植物根发育的调控,通过miRNAs类似物和剪切位点突变的NF-YA基因的相关分析表明,miR169在根的生长和分支上发挥了特殊的调控作用。miR169defg通过抑制NF-YA2和 NF-YA10的转录和蛋白翻译影响了拟南芥主根的生长和侧根的起始[13]。干旱胁迫诱导了sly-miR169在番茄体内的积累水平,相应地下调了siNF-YA1/2/3的转录水平,过量表达sly-miR169c的转基因植株降低了气孔的开放、呼吸速率和叶片的失水率,从而增强了对干旱的耐受性[14]。这些结果表明,尽管miR169是一个非常保守的家族,但miR169在不同物种中的功能并不完全一致,参与干旱调节的主效靶基因也可能并不完全相同。
干旱胁迫是水稻生长发育的重要环境影响因子之一,能够导致水稻减产,甚至死亡。目前,水稻干旱胁迫反应研究已经深入到分子水平,涉及抗旱基因克隆、定位及功能分析等[15]。水稻miR169家族中对植物调控作用主要包括miR169g和miR169n/o两部分,其中miR169n和miR169o位于同一个miRNA基因簇中,二者相距3 707个碱基[16]。然而,在干旱胁迫条件下,水稻miR169o及其靶基因早期表达变化及其组织特异性尚不清楚。
为了明确缺水或干旱胁迫条件下,水稻miR169及其靶基因的表达调控模式,本研究利用qRTPCR法检测了胁迫初期水稻根、茎、叶中miR169o以及靶基因OsNF-YA1(Os03g48970)、OsNF-YA2 (Os12g42400)和OsNF-YA3(Os02g53620)的表达动态变化,以期明确缺水或干旱胁迫初期,miR169o及其靶基因的动态表达调控模式和组织特异性情况。 1 材料与方法 1.1 材料
水稻品种日本晴(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)由本实验室保存;Trizol Regent购自Invitrogen公司; TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit购自ABI公司;RQ1 RNase-Free DNase、GoScriptTM Reverse Transcription System、GoTaq® qPCR Master Mix购自Promega公司;其他试剂均为国产分析纯;实验引物由北京华大基因科技有限公司合成。
水稻培养Hogland营养液[17]:10 mmol/L KH2PO4,2 mmol/L MgSO4,1 mmol/L CaCl2,0.1 mmol/L Fe-EDTA,50 μmol/L H3BO4,12 μmol/L MnSO4,1 μmol/L ZnCl2,1 μmol/L CuSO4,0.2 μmol/L Na2MoO4,pH5.5-6.0。 1.2 方法 1.2.1 水稻幼苗培养及其缺水胁迫处理
将水稻种子置于培养皿清水中,在37℃下催芽2 d。待幼芽长至1 cm长时,将其种植于泡沫板上,将泡沫板置于清水中,覆盖蛭石。4 d后将泡沫板移至含3 mmol/L KNO3的Hogland培养液中培养(28℃、16 h光照、8 h黑暗)。选取生长3周的水稻幼苗,将其从营养液中取出,用干燥吸水纸迅速吸除根部水分,进行脱水干旱胁迫处理0、0.5、1、2和4 h,然后采集根、茎和叶部样品,经液氮速冻后,置于-80℃保存备用。 1.2.2 水稻总RNA提取及cDNA合成
经缺水处理0、0.5、1、2和4 h的水稻根、茎和叶组织样品按照稍作改进的Trizol方法[18]进行水稻总RNA提取。经DNase处理后,用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性及基因组DNA是否完全去除,用Nano Drop 2000分光光度计检测RNA浓度。miR169o反转录茎环引物为5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAGGCA-3',按照ABI TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription试剂盒方法进行反转录;靶基因OsNF-YAs反转录引物为Oligo dT,按照GoScriptTM Reverse Transcription System试剂盒方法进行反转录。 1.2.3 实时荧光定量PCR分析
利用Primer premier 5.0软件,设计miR169o、靶基因OsNF-YAs和内参基因U6的特异性引物(表 1)。以合成的cDNA为模板,按照GoTaq® qPCR Master Mix试剂盒方法,用ABI 7500实时定量PCR仪进行qRT-PCR检测。对照样品为未经胁迫处理的水稻样品。miR169o及其靶基因相对表达量按照2-△△ Ct法计算[19],其中△△Ct=(Ct样品-CtU6) TimeX-(Ct对照样品-CtU6) Time0,Time X表示任意时间点,Ct为荧光阈值。
以U6为内参基因、未处理样品为对照,进行缺水处理水稻根部样品qRT-PCR检测。实验中 miR169o、OsNFYAs和U6基因熔解曲线均为单一峰。分别计算各处理样品中基因的相对表达量。结果(图 1)表明,水稻根部miR169o表达量总体上呈升高趋势,在缺水处理0.5 h时出现极显著差异,在缺水处理2 h时达到最高峰,之后逐步下降,但仍明显高于对照。OsNF-YA2的表达动态变化与miR169o的完全相反,符合miRNA与靶基因的对应关系;OsNFYA1的表达动态与miR169o相似;OsNF-YA3在缺水处理1-4 h之间的表达动态与miR169o相反。
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| 图 1 经缺水处理的水稻根部miR169o及OsNF-YAs表达 |
经缺水处理的水稻茎部miR169o表达动态与根部相似(图 2),但总体表达变化幅度不超过5倍。缺水处理1 h表达量迅速升高,2 h时出现一个2倍的峰值,随后下降,但4 h时但仍明显高于对照。3个OsNF-YAs的表达动态变化趋势基本一致,均与miR169o相反,符合miRNA与靶基因的对应关系。
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| 图 2 经缺水处理的水稻茎部miR169o及OsNF-YAs表达 |
经缺水处理的水稻叶部miR169o的表达量整体呈上升趋势(图 3)。缺水处理0-0.5 h迅速上升,在0.5 h时出现显著差异,0.5-1 h其表达基本维持此水平,随后迅速下降,在2 h时降至最底点,随后又上升至4倍峰值;OsNF-YA2和OsNF-YA3的表达在初始0.5 h显著下降,与miR169o呈相反趋势,但0.5-4 h的表达趋势同miR169o一致;OsNF-YA1的表达趋势与miR169o一致,同其在根部表达情况类似,不符合miRNA和靶基因的对应关系。
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| 图 3 经缺水处理的水稻叶部miR169o及OsNF-YAs表达 |
miRNA在植物生长发育和应对逆境胁迫反应中发挥着重要的调控作用。近年来,针对miR169家族及靶基因NF-YAs的研究涉及到拟南芥[20]、水稻[21]、番茄[14]、大豆[10]、山杨[22]等植物,主要包括早花[12]、干旱[14]、高盐[16]、低氮[7]等性状的调控方面。水稻中miR169家族包含17个成员,代表 9个仅存在微小差别的不同的成熟序列。在高盐胁迫中,仅miR169g和miR169n/o受到诱导,其余miR169家族成员对盐胁迫无响应[16]。PEG 6000 (polyethylene glycol 6000)模拟干旱处理后,芯片分析表明水稻miR169家族中几个成员都能被诱导表达,然而Northern blot仅能验证miR169fg的诱导表达[23],这可能是由于不同技术方法的灵敏度和特异性所决定的。通常来说,盐胁迫和干旱胁迫之间存在着密切的联系,尽管已经报道miR169o在高盐胁迫下诱导表达,但对于干旱胁迫下水稻miR169o的动力学表达变化尚无报道。本研究对缺水干旱胁迫初期水稻miR169o及其靶基因的动态变化趋势进行了监测。对于胁迫条件设置,本实验室未采用PEG6000处理法,而是对植物进行缺水处理来模拟干旱胁迫初期的情况,这种处理方式较PEG6000处理更为剧烈,在4 h时植株已经出现明显萎蔫症状。在干旱胁迫初期0-4 h内,尽管水稻miR169表达水平在根、茎、叶中都有不同程度升降,但其表达总体上呈上升趋势。
本研究表明,干旱胁迫下miR169o在水稻不同组织中的表达具有明显的组织特异性。其在根、茎部的表达趋势基本一致,但根部变化幅度更大,可高达171倍。有报道在盐胁迫条件下玉米根部应答反应比叶部更快、更敏感[24]。本研究发现miR169o根部变化远高于茎部,可能是因为miR169o在干旱胁迫下根中的应答反应更为敏感。miR169o叶部表达趋势不同于根茎部,胁迫初始上调迅速,可能是干旱胁迫诱导了根部ABA积累、从根部运输到叶片,气孔开闭受抑制,从而减少水分流失[25, 26, 27]。因此,miR169o在叶部能迅速应答干旱胁迫,但其表达量变化范围远远小于根部。
本研究还发现,miR169与靶基因的表达变化趋势在茎部完全对应,但在根、叶部并不能完全对应。可能的原因是在干旱胁迫反应中,有其它miRNA、激素以及调控因子同时参与了调控过程[5]。有报道拟南芥NF-YAs家族分为3个亚组,不同亚组在根或地上部的积累量不同[7]。水稻OsNF-YAs家族也分为不同亚组,OsNF-YA1、OsNF-YA2和OsNFYA3处于不同亚组中,3个靶基因在根茎叶部表达趋势并不一致。其具体分布状况尚待研究。 4 结论
本研究定量分析了在干旱胁迫下水稻不同组织中miR169o及靶基因OsNF-YAs表达的动态变化,发现miR169o在干旱胁迫下表达量总体上升,其在根茎部动态变化趋势基本一致,根部在应对干旱胁迫应中更敏感,叶部反应更为迅速。靶基因OsNFYA1、OsNF-YA2、OsNF-YA3的表达在茎部与miR169o完全对应,而在根、叶部并不完全对应。
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