猪肉品质已经被列入猪的品种选育的重要技术指标,劣质猪肉表现为PSE (Pale,soft,exudative)肉和DFD (Dark,firm,dry)肉猪。自1953年Ludvigsen首次提出PSE猪肉概念以来,在世界各地均有类似报道^[1]。美国PSE猪肉发生率为5%-20%,日本为8.5%-11.5%^[2],丹麦为10%-15%^[3]。我国各地PSE猪肉发生率在10%-30%之间,个别地区高达60%-70%。猪骨骼肌兰尼定受体(Ryanodine receptor 1,RYR1)基因的有害突变型为氟烷基因(halothane,Haln),是导致猪应激综合征(Porcine stress syndrome,PSS)、发生恶性高温综合症状(malignant hyperthermia syndrome,MHS)、产生PSE肉或DFD肉的遗传基础^[4],由于兰尼定受体cDNA的C¹⁸⁴³ → T¹⁸⁴³突变使兰尼定受体蛋白结构和功能的改变,导致了劣质猪肉的产生^[5]。现大量研究表明,氟烷有害基因还对猪的繁殖力有影响,Halⁿ型相对于Hal^N型在繁殖性能上表现为一定的劣势^[6]。在我国大多数地方猪种未见报道有Halⁿ基因^{[7, 8, 9]},仅少数品种有Halⁿ基因存在,如民猪Halⁿ基因频率为15.62%^[9]。随着人们生活水平的不断提高,消费者对肉质提出了更高的要求,猪肉不仅要卫生,而且还要瘦肉率高、口感好,生产优质猪肉已迫在目睫。因此,对猪进行基因诊断,对PSE猪肉和DFD猪肉的形成机理进行探讨,找出有效的防控措施,建立"抗应激敏感基因专门化品系",具有重要的经济价值和实际意义。本研究针对贵州省5个地方猪种及较为普及的三元商品猪生产基地进行氟烷基因检测研究,旨为贵州地方猪种"抗应激敏感基因专门化品系的培育提供技术支撑。 1 材料与方法 1.1 材料

白洗猪36份血样采集于贵州省施秉县,地方猪种DNA样黔北黑猪14份、糯谷猪22份、宗地花猪31份、从江香猪29份皆为本实验室保存样,三元商品猪19份血样采集于贵阳市某种猪场。

血液基因组柱式小量提取试剂盒与2×Es Taq MasterMix购于康为世纪生物科技公司,限制性内切酶Hha I购于宝生生物工程(大连)有限公司,DNA Marker购于生工生物工程(上海)有限公司,引物合成由生工生物工程(上海)有限公司完成。 1.2 方法 1.2.1 PCR扩增

按血液基因组柱式小量提取试剂说明书提取DNA后,扩增RYR1基因的DNA片段。引物设计^[5],上游引物:5'-TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCA-3';下游引物:5'-ATTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG-3'。欲扩增产物是含RYR1基因cDNA第1 843位点长度为660 bp的片段。PCR反应体系20 μL:2×Es Taq MasterMix 10 μL,上、下游引物各0.8 μL (10 μmol/L),基因组DNA模板2 μL,加灭菌水至终体积20 μL。PCR扩增条件:95℃预变性5 min,95℃变性30 s,55-65℃退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。 1.2.2 酶切反应

酶切反应体系50 μL:10×Quick Cut Green Buffer 3 μL,10 μL PCR产物,限制性内切酶Hha I 1 μL,加灭菌水至终体积30 μL。混匀试剂后瞬时离心,37℃水浴酶切10 min。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。 2 结果 2.1 PCR反应条件优化

通过DNA池技术摸索最佳PCR反应条件,RYR1基因cDNA含第1 843位点长度为660 bp (全序列17 721 bp-18 381 bp片段)的片段在20 μL PCR反应体系中,退火温度63℃反应条件下扩增良好。对各样分别进行PCR扩增,扩增出660 bp的目的条带(图 1)。

M:Marker;1-6:分别依次代表宗地花猪、糯谷猪、从江香猪、黔北黑猪、白洗猪及三元商品猪PCR扩增产物 图 1 各猪种RYR1 基因PCR 产物

图选项

Hha I内切酶的识别位点为5'-GCG↓C-3'。PCR扩增产物是含RYR1基因cDNA第1 843位点长度为660 bp的片段,根据电泳图谱中的带型判断氟烷基因型。如果猪的基因型为Hal^NN,由于胞嘧啶未突变成胸腺嘧啶,扩增产物被酶切为494 bp和166 bp,因此电泳形成两条带;如果基因型为Halⁿⁿ时,发生基因突变的酶切位点消失,Hha I内切酶不能识别,对PCR产物不能酶切,所以只能看到660 bp 1条带;如果猪的基因型为Hal^Nn杂合子,扩增产物则可以电泳形成660 bp、494 bp和166 bp 3条带^[11]。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,可以观察到RYR1基因的DNA酶切片段(图 2)。经检验,三元商品猪19份样品中检测出10份样品RYR1基因型为Hal^Nn、9份样品为Hal^NN、无Halⁿⁿ。

M:DNA Marker;1,4,5,6:酶切结果为HalNn型;2,3:酶切结果为HalNN 图 2 三元商品猪PCR 产物酶切结果

图选项

对白洗猪、黔北黑猪、宗地花猪、糯谷猪及从江香猪5个贵州省地方猪种132份样品进行了检测,全为RYR1基因抗应激敏感Hal^NN型,三元商品猪19份样品中检测到两种基因型,应激敏感基因隐性携带型Hal^Nn与抗应激敏感Hal^NN型,未检测出应激敏感基因型Halⁿⁿ,RYR1基因cDNA C¹⁸⁴³ → T¹⁸⁴³突变的基因型频率和基因频率,如表 1所示。

表 1 三元商品猪RYR1基因C¹⁸⁴³ → T¹⁸⁴³突变的基因型频率和基因频率

表选项

氟烷基因检测技术在指导生产过程中引物设计至关重要,引物设计可根据GenBank中的猪RYR1基因序列进行设计,亦可参考已发表研究报告中提供的参考序列。常见的氟烷基因3个引物设计序列见表 2,本研究采用Fujii等^[5]设计的引物,引物在PCR扩增体系中最适温度条件为63℃。

表 2 常见的3 对引物设计序列

表选项

在近年的研究报道中,国外引进猪种n型等位基因频率较高,皮特兰猪、英国大白猪、台湾杜洛克猪、丹麦杜洛克、迪卡猪C系、迪卡猪F系的Haln型等位基因频率分别为100%、12.5%、5.3%、4.6%、8.3%及4.2%^[13]。本实验对5个贵州省地方猪种及三元商品猪共151份样本的RYR1基因限制性内切酶片段长度多态性进行了检测。结果表明,5个贵州省地方猪种中全为抗应激敏感基因Hal^NN型,三元商品猪群中检测到10例应激敏感基因隐性携带型Hal^Nn,占猪群体的52.63%(n=19),Halⁿ型等位基因频率为26.32%。结果中三元商品猪Halⁿ型等位基因与国外猪种相比,国外种猪Halⁿ型等位基因频率保持较高水平;与朱锋钊^[14]报道的外三元猪群RYR1基因HalNn型比例为11.11%、Halⁿ型等位基因频率为5.56%相比,HalNⁿ型基因比例上升了41.52%,Halⁿ型等位基因频率上升了27.62%,Hal^Nn型基因在试验三元商品猪群中的比例呈明显上升趋势;本实验5个贵州本地猪种检测全为抗应激敏感基因Hal^NN型,与朱锋钊^[14]报道相同,且首次对贵州省优良地方猪种白洗猪、黔北黑猪进行了RYR1基因检测,二者皆为抗应激敏感基因Hal^NN型。 3.3 RYR1基因对肉质的影响

近来的研究表明,Halⁿ等位基因的出现与欧洲猪种的高瘦肉率选育直接相关^[15],RYR1基因Hal^Nn型猪与Hal^NN型比较,Hal^Nn型猪骨骼肌应激敏感性高,应激易使肌细胞肌浆网终池中的钙离子大量快速地释于肌浆,引起肌细胞快速收缩,随着ATP降解供能,钙离子又被泵回肌浆网终池,肌浆内钙离子浓度下降,肌细胞转入静息期。含Halⁿ型等位基因猪遇到应激时,如此反复刺激肌细胞并促使其生长,肌肉生长的需求增加致使Halⁿ型猪对饲料转化成瘦肉的需求增加,瘦肉比重亦随之增大,故Haln型猪比正常猪肌肉更为发达。RYR1基因的n型等位基因与高瘦肉率正相关,但也具高的PSE发生率。据研究,RYR1基因Halⁿⁿ型猪即使采用最优处理,其产生PSE肉的比率也高达80%以上,RYR1基因Hal^Nn型猪产生各种劣质肉的比率达到36.8%,显著高于Hal^NN型猪22.5%的水平^[16]。 3.4 RYR1基因对繁殖力的影响及效益分析

杜立新等^[17]报道,Hal^Nn型母猪的产活子数比Halⁿⁿ型多1.74头。Stalder等^[18]对某应激敏感合成系研究表明,HalNN型的21日龄成活率则比HalNn型高出9.33%(^P < 0.05)。蒋思文等^[19]报道,Hal^NN型和Hal^Nn型猪的窝总产仔数、窝产活仔数、初生窝重及育成数、断奶窝重均极显著高于Halⁿⁿ型猪(P < 0.01),断奶头数Hal^NN显著高于Halⁿⁿ型(P < 0.05)。刘月环^[20]报道,Hal^N基因对总产仔数、20日龄仔猪成活率、断奶前后仔猪的生长效应显著(P < 0.05)。总的来说,Halⁿⁿ型相对于Hal^NN和Hal^Nn型在繁殖性能上表现出一定的劣势。刘桂琼等^[12]研究表明,Halⁿ基因对产仔数的遗传效应影响较大,凡带有RYR1基因Halⁿ型的母猪,其产仔数、产活仔数比纯合Hal^NN母猪少,从头3胎总平均数看,Halⁿⁿ母猪比Hal^NN母猪窝产仔数、产活仔数、断奶仔数少1.92、1.72和1.57头,Hal^Nn母猪比Hal^NN母猪少0.80、0.84和0.72头。本研究商品群体中Hal^Nn、Hal^NN、Halⁿⁿ型比例为52.63%、47.37%和0。根据孟德尔遗传定律可测算出该商品猪群父母代猪群基因型为Hal^NN、Hal^Nn、Halⁿⁿ,基因型比例阈值为0-47.37%、0-94.74%、5.26%-52.6%,按试验场300头基础母猪,利用年限8胎次,可计算出该场仅因RYR1基因对繁殖性能的影响,至少损失808.55头猪仔。若对该场300头基础母猪及公猪进行RYR1基因检测,约花费检测成本0.5万元,对该场进行氟烷基因筛选投资回报可观。 3.5 猪场氟烷基因型的净化

氟烷有害基因Halⁿ型等位基因属氟烷敏感基因,Fujii等^[5]对氟烷基因的克隆分析和比较正常猪与应激猪兰尼定受体cDNA序列发现,兰尼定受体cDNA的C¹⁸⁴³ → T¹⁸⁴³突变使兰尼定受体蛋白结构和功能的改变。这种改变导致劣质猪肉的产生^[4]。氟烷基因一方面导致肌细胞肥大,提高胴体瘦肉率,另一方面易诱导发生恶性高热综合征产生PSE肉,降低肌肉品质,随氟烷基因n型频率的增加,猪的肉质性状、生长发育性状和繁殖性状都逐渐变劣^[21],已给世界养猪生产造成了巨大损失。在常规育种过程中,只是淘汰掉有应激综合征表现的隐性纯合个体,而让杂合体自由繁殖,那么隐性基因频率在选育前几年降低很快,以后则越来越缓慢,难以完全消除,而氟烷基因杂合子猪在生产性能和体型外貌上具有杂合优势,通过常规选种技术更易被选作种用^[10]。本研究对三元商品猪19份样本的RYR1基因多态性检测结果说明,在猪群的父母代种猪中一定含有RYR1基因Hal^Nn型猪、Hal^NN型和Halⁿⁿ型。从整个养猪生产综合来看,Halⁿ等位基因具降低产出的效应,因此有必要应用目前各种检测手段指导实际生产,消除氟烷隐性及杂合有害基因,在种猪群中淘汰这一基因,建立"抗应激敏感基因专门化品系",达到猪场氟烷应激敏感基因型的净化,最终生产出优质的猪肉。 4 结论

本实验利用PCR-RFLP法对白洗猪、黔北黑猪、宗地花猪、糯谷猪、从江香猪5个地方猪种及三元商品猪共151份样本进行了RYR1基因检测,首次对黔北黑猪和白洗猪RYR1基因检测进行报道,5个地方猪种均不含氟烷敏感Halⁿ型等位基因。本实验三元商品猪群中Hal^Nn基因型占猪群体的52.63%(n=19),Halⁿ型等位基因频率为26.32%,Hal^Nn基因型在实验猪群中的比例较大。建议运用PCRRFLP法对基础母猪RYR1基因型净化,在种猪群淘汰RYR1基因Halⁿ型等位基因,最终建立"抗应激敏感基因专门化品系"。