DNA甲基化是一种进化上保守且具有重要生物学功能的表观遗传机制^[1]。在不改变DNA序列的基础上,通过将甲基添加到DNA分子上,可以对生物体的遗传表达进行调控。DNA甲基化会导致染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,进而对基因的表达产生影响。

在基因组内,DNA甲基化状态可分为暂时性的和永久性的两种。环境的变化可导致基因甲基化状态的改变,进而对细胞的转录物组(Transcriptome)产生影响,因此,即使是基因型完全相同的个体,也会产生表型上的差异,就像在同卵双胞胎中出现的情况。在不同的生物门类中,DNA甲基化的状态有很大的不同。无脊椎动物通常表现出基因组内不均一的甲基化状态,甲基化多发生于转录区域,这一模式因此也被称为基因体甲基化(Gene body methylation,GBM)^[2]。生物全基因组范围内的甲基核苷酸也可被称为生物的甲基化组(Methylome)。

迄今为止,关于DNA甲基化的研究多数来自医学领域,特别是人类疾病相关基因的甲基化情况,但是关于无脊椎动物基因组水平的甲基化研究还是比较少。相关的研究主要集中于以下领域:意大利蜜蜂(Apis mellifera)的等级分化,家蚕(Bombyx mori)的丝腺表达,太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的适应机制,佛罗里达弓背蚁(Camponotus florida-nus)和印度跳蚁(Harpegnathos saltator)的进化历程,造纸胡蜂(Polistes dominula)及丽蝇蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis)的发育调控等。本文将主要对这几种生物中发现的DNA甲基化模式及相关功能进行综述。

据推测DNA甲基化进化自原始细菌的限制-修饰系统,由原始的免疫功能发展为基因表达调控功能^[3]。在细胞中,DNA甲基化由DNA甲基化酶(DNA methyltransferases,DNMTs)催化完成。DNMTs可依据活性的不同进行分类,在哺乳动物中,DNMTs的作用可分为初始合成(de novo)和维系现状(Maintenance)两类^[4]。具初始合成功能的DNA甲基化酶类以DNMT3蛋白质家族为代表,负责基因组中新的甲基化模式的产生,而具维系现状功能的DNA甲基化酶类以DNMT1蛋白质家族为代表,负责复制过程中已有甲基化模式的维系。DNMT2蛋白质家族起先也被认为是催化DNA甲基化的酶类,但是最近的研究表明其作用是对tRNA进行甲基化^[5]。因此,在生物体内,通常认为DNMT1与DNMT3的共同存在标志着甲基化系统的正常运转。但也有例外,如在家蚕的体内,虽然只有DNMT1而没有DNMT3的存在,但是却表现出与蜜蜂基因组相似的甲基化水平(0.7% vs 0.5%)^[1]。

除此之外,甲基化CpG结合蛋白(Methyl-CpGbinding domain proteins,MBDs)也可以特异性地结合甲基化的CpG并在不同水平发挥表观遗传调控作用。在哺乳动物中,MBD中包含有一个甲基化CpG识别结构域,因此可以特异性地结合甲基化的DNA,并可将染色质重塑因子定位到DNA甲基化的区域,进而对表观遗传调控产生影响^[6]。但在无脊椎动物中,相关的作用细节仍然尚待明确。

在原核生物中,甲基化多发生于腺嘌呤位点,而在真核生物中,绝大多数的甲基化位点是胞嘧啶^[7]。在动物界中,胞嘧啶的甲基化多发生于CpG二核苷酸序列之中,而在植物界和真菌界,在CHG或CHH序列中也可发现甲基化的胞嘧啶^[8]。在植物中,DNA甲基化多发生于重复序列或转座子区域,甲基化核苷酸类似于"铆钉"将转座子钉住,以抑制其转移活性^[9],但在无脊椎动物中,DNA甲基化主要发生于基因内部,基因间区大部分未被甲基化,重复序列或转座子区域的甲基化情况在昆虫中几乎不存在^[10]。在无脊椎动物中,外显子和内含子的甲基化模式也表现出较大差异,如在牡蛎中,外显子和内含子存在较高的甲基化水平^[11],而在金小蜂中,内含子的甲基化水平却要显著低于外显子^[12]。

有些生物基因组的甲基化位点展现出高度的特异性,如桃蚜(Myzus persicae)的基因组虽然整体来说缺乏甲基化修饰。但是在其解毒酶的编码区却存在有CpG甲基化的情况,其中胞嘧啶甲基化的缺失将导致基因的沉默,进而引起昆虫抗药性的缺失^[13]。对于另一种蚜虫,麦二叉蚜(Schizaphis graminum)的研究也得出了类似的结论^[14]。

基因组水平的研究显示了无脊椎动物不同转录单元之间甲基化水平的巨大差异,有些转录单元被高度甲基化而另一些则具有极其低度的甲基化水平^[15]。甲基化与转录水平之间的关系也展现出了种间特异性,在海葵(Nematostella vectensis)和家蚕中的研究都表明,基因的甲基化水平与表达产物mRNA的水平之间存在有正相关^{[1, 16]}。但是在对蜜蜂中的研究显示,表达最为频繁和表达最不频繁的基因都被甲基化了^[1]。因此,对相关遗传及进化机制的了解仍有赖于对于生殖细胞系及体细胞甲基化图谱的深入研究。

在脊椎动物中,基因组的甲基化水平整体较高,CpG二核苷酸中大约70%-80%的C被甲基化,而无脊椎动物基因组的甲基化水平通常较低,两种重要的模式生物,果蝇(Drosophila melanogaster)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)均缺乏DNA甲基化的情况^[17]。对家蚕丝腺甲基化谱的研究发现,大约0.11%的基因组胞嘧啶被甲基化修饰,比哺乳动物和植物低至少50倍^[16]。通常,DNA甲基化的情况分布于整个基因组中,但是在基因的5'末端,DNA甲基化程度较低且出现了两种不同的分布模式。在组织特异性表达基因的启动子区域,CpG含量较低但甲基化水平较高。而在持续表达的持家基因的启动子区域,CpG含量较高,甲基化水平较低^[18]。

由于技术手段的有限和工作量的巨大,在实际研究中很难对生物整个基因组进行DNA甲基化测定,相关数据多来自对相关序列进行的计算机推断分析(in silico)的结果。例如,甲基化的胞嘧啶可以自发性地脱氨形成胸腺嘧啶,这一突变很难被DNA修复机制识别纠正,随着时间的推移,基因组中的CpG序列会逐渐消失。因此序列之中较低的CpG水平就暗示了甲基化过程的存在,通过比较CpG的实际存在水平与期望水平(Observed to expected CpG contents,CpG O/E ratio),我们可以对甲基化的进程有所了解^[19],这一过程又被称为标准化CpG含量分析(Normalized CpG content analysis)^[20]。对于蜜蜂基因组不同区域的标准化CpG含量分析表明,有些基因经历了广泛的脱氨过程因而是甲基化作用的主要位点^[21],这一研究结果其后也得到了其他DNA甲基化功能相关研究的证实^{[1, 16, 17, 22]}。在人虱(Pediculus humanus)中同样出现了只存在DNMT1而不存在DNMT3的情况,但是对于基因组标准化CpG含量的分析却暗示了甲基化过程的存在^[20]。

基因不同的甲基化模式对应的是转录水平及功能的不同。在昆虫中,高度甲基化的基因通常具有持家功能并得到了高效表达^[23],而低度甲基化的基因则可能执行的是可诱导的调节功能如细胞信号传导或环境刺激性反应^[24]。在社会型昆虫中,环境诱导性的甲基化导致了不同等级相关表型的出现。在蜜蜂中,蜂王浆能通过DNA甲基化作用来修饰蜜蜂的基因组,并干扰使幼虫变为工蜂的基因的表达^[25]。对同一蜂巢中不同分工的蜜蜂如采蜜蜂和保育蜂而言,其负责调控基因表达的DNA甲基化模式也存在有差异。当研究人员采取手段诱使采蜜蜂转化为保育蜂时,其甲基化模式也会随之发生相应改变^[26]。对于较为原始的社会性昆虫造纸胡蜂的研究也表明,其基因组内存在有与等级分化相关的位点特异性甲基化DNA^[27]。

对于不同社会等级和发育阶段的佛罗里达弓背蚁和印度跳蚁的DNA甲基化研究表明,虽然这两种蚂蚁在1亿多年以前就已经分化,但某些与等级分化及发育变化相关的差异甲基化基因在这两种不同的蚂蚁中是保守的,包括与繁殖、端粒维持及非编码RNA代谢调控相关的一些基因^[28]。在对湿木白蚁(Zootermopsis nevadensis)进行基因组测序后,也发现了DNA甲基化模式和可变剪切对其社会化分工的表观遗传控制作用^[29]。因此,DNA甲基化对于维系社会性昆虫的基因等级差异性表达具有非常重要的功能,而相对于非甲基化的基因而言,甲基化的基因在其功能的维系上也具有更高的保守性。

在脊椎动物的基因启动子区,CpG甲基化的情况较少出现。在哺乳动物中的研究表明,有些特定转录因子对其结合位点的DNA甲基化非常敏感,在这种情况下,即使是在C+G含量少的区域,启动子、增强子等基因调控区的甲基化也会阻止转录因子结合,从而抑制基因的表达^[30]。例如,对于海兔(Aplysia)的研究表明,CREB2基因启动子区的CpG岛甲基化将抑制基因的表达,从而影响到记忆相关突触的可塑性调控^[31]。在转录过程中,组织特异性的甲基化通常会降低转录延伸的效率,但在某些特殊的情况下,也可增强转录的效率^[32]。

在牡蛎基因组中,DNA的甲基化会导致与之结合的转录因子的改变,进而增加转录变异体(Transcript variants)的数量^[33],因为牡蛎生活在环境高度多变的潮间带,其环境温度及盐度在不同潮位和季节会产生很大的变化,而牡蛎一般附着在浅海物体和礁石上,不能够通过主动移动来逃避不利环境的影响,因此必须具有一套遗传机制使其对温度、盐度、干露、重金属和海区常见病原等具有很强的抵抗力,而甲基化可以使其有限的基因更为灵活地应对环境的变化。与其他无脊椎动物门类相比,牡蛎基因组中胞嘧啶甲基化程度较高为2%(昆虫中为0.15%)^{[1, 11]},而对于牡蛎生殖系细胞的研究表明,在配子发生的过程中,雌雄配子间及配子的不同发育阶段甲基化模式均展现出一定的差异^[34],在牡蛎成体腮细胞的单碱基分辨率甲基化组图谱中也发现了启动子区域的甲基化状况^[11]。因此,DNA甲基化对于牡蛎早期发育阶段的细胞分化有重要影响,还可通过增加转录变异体的数量来提高表型的灵活性,增加生物体应对环境变化的能力。

在测序基础上对高分辨率甲基化组进行分析,可以看到外显子和内含子之间也存在着甲基化差异,暗示着DNA甲基化可能参与了调控剪切^[30]。研究表明,在蜜蜂中,DNA甲基化主要集中在外显子区域,而多数转录物也来自于甲基化的基因,这可能是因为甲基化的外显子在可变剪接过程中起到了积极作用而导致的结果^[35]。外显子DNA甲基化的差异可能与可变剪切相关,如外显子遗漏以及剪切位点的选择,从而影响到基因表达^[28]。对于蜜蜂的研究表明,在蜂后和工蜂中单个基因GB18602由于甲基化模式不同而出现了差异性表达,此基因有一长一短两种不同的转录物,在较长的转录物中缺失了一个包含终止密码子的外显子,DNA甲基化与外显子遗漏展现出密切的关系^[22]。蚂蚁的DNA甲基化也多发生在活跃转录的外显子区域,特别是基因的第二个外显子上。在哺乳动物中,DNA甲基化对外显子遗漏与可变剪接(Alternative splicing)的影响也已得到证实^[36]。

但是,DNA甲基化并非外显子遗漏的必要条件,在金小蜂基因组中,甲基化与非甲基化基因在可变剪接水平上并无明显的差异^[12]。因此,外显子选择与甲基化之间的关系还在进一步的研究过程当中。

在无脊椎动物中DNA甲基化展现出两种不同的模式:高甲基化水平和低甲基化水平的基因在进化机制上表现出明显的差异。在基因表达过程中,DNA甲基化执行的多是"微调"而非"开关"功能。因为基因表达是一个整体上趋于随机的事件,而DNA甲基化将导致其动态过程中的偏差。在生物体中,DNA甲基化与表型特征之间的关系取决于年龄、性别等多个因素。在不同的发育阶段,不仅是甲基化的基因类型不同,甚至同一个基因的不同区域也可出现差异。因此,DNA甲基化会对细胞的转录物组(Transcriptome)产生影响,进而影响生物的表型^[37]。例如,三倍体牡蛎通常是不育的,但是种群中的少数个体("alpha"三倍体)却可以产生成熟的配子体^[38],而这些个体的甲基化状态与种群中其他不育的三倍体不同,却与可育的二倍体相似^[39]。

在蜜蜂生殖细胞系中,广泛表达的基因被甲基化而等级特异性基因则缺乏甲基化,因此等级特异性基因可能具有更高的表型遗传灵活性,可以通过暂时的甲基化与去甲基化来调控其表达过程^[21]。在金小蜂中,甲基化的基因在各个发育阶段都获得了组成性表达,而非甲基化基因则展现出更为动态的表达模式^[12]。

通过不同生物基因组的比对发现,高度甲基化的基因通常具有较低的遗传多样性水平与较多的直系同源基因(Ortholog)^[23],在金小蜂中的研究还表明,在缺乏生殖系甲基化的基因中,出现了较高的遗传多样性水平^[40]。这是非常令人惊讶的一点,因为甲基胞嘧啶具有高突变性,所以长时间的进化应该会导致同源基因间较大差异的产生。但是因为CpG含量较低的基因中胞嘧啶导致的突变率也较低,而CpG含量较高的基因通常功能上比较重要,因此较强的选择压力导致了进化上保守性的产生^[24]。

性成熟的个体可以用甲基化标记生殖细胞系,进而将甲基化组传递给后代。如果这一过程持续发生,将会导致整个基因组的进化改变^[34]。研究表明,与有性繁殖的陆地植物及动物不同,无性生殖的单细胞动物和真菌很少或没有DNA的甲基化情况^[1]。尽管甲基化是一种古老的进化机制,而且毫无疑问会增加基因突变的几率,但是在有性生殖的生物中,它仍然在基因组进化中发挥重要的作用。比较基因组学的研究表明,在经历了1.9亿年的分支进化后,蜜蜂和金小蜂的同源基因仍然展现出高度相似的甲基化水平^[40]。此外,减数分裂过程中的基因转换(Gene conversion)事件也会导致基因组中CpG含量的升高^{[21, 41]},不同物种基因组中CpG水平的维系可能是不同进化历程下不同选择压力造成的结果。

1975年,Riggs和Holliday等^{[42, 43]}首次提出甲基化胞嘧啶可以在真核生物基因表达和细胞分化中发挥特定的作用。随着DNA甲基化研究范围的扩大,甲基化与基因表达的复杂的关系逐渐被揭露出来。2009年,借助于功能强大的计算机和新一代测序技术,两种人类细胞的全部表观基因组图谱得以绘制,它们分别是胚胎干细胞和肺部纤维原细胞^[44]。近年来,由于高通量表观基因组绘图技术的快速发展,已生成了成千上万的甲基化图谱,对这些图谱的解读也日益深入。

但是,问题总是与发现伴随而来。目前,在测序基础上可以对高分辨率甲基化组进行分析,但这样的技术生成的是DNA甲基化的静态图谱,而无法展示甲基化稳定性随时间推移的变化。研究显示,有些转录因子的结合发生在DNA甲基化改变之前,这说明DNA甲基化的许多改变是基因调控的产物而非其原因。因此,要正确解读甲基化图谱,必须将指导基因调控的甲基化与转录因子结合所造成的甲基化区分开来^[30]。

在哺乳动物中进行的研究表明,相似的DNA甲基化状态可能导致不同的基因表达结果。是什么导致了不同生物基因组内的甲基化模式;甲基化是控制着转录过程,还是仅仅反映了转录状态;因为不同物种间DNA甲基化的分布模式存在有巨大差异,这是否意味着其功能上也具有多样性;在对生物基因组的大规模编程中,甲基化模式具有什么样的含义。虽然基因体(Gene body)是真核生物进化上最保守的DNA甲基化靶,但是,基因体DNA甲基化的调控功能在很大程度上仍然是未知的。

除此之外,在脊椎动物中,DNA甲基化相关蛋白质也参与了组蛋白修饰及染色质重塑的过程^[45],但是DNA甲基化与其他表观遗传机制之间的相互作用尚待深入研究。来自不同物种不同组织的甲基化图谱与转录组信息将有助于我们了解甲基化与转录调控之间的复杂关系。另一个在哺乳动物中的重要发现是DNA甲基化可能在基因组印记(Genomic imprinting)中起到一定的作用,从而导致带有亲代印记的等位基因的不同表达特性^[46],而对于社会型昆虫(如蜜蜂)的研究将使我们对于相关机制有进一步的了解。

虽然目前对于无脊椎动物DNA甲基化的机制与功能已经有了一些较为确定的认识,但就总体而言,这个领域仍充满了疑问。现已证明表观遗传调控机制比我们原来想象中更为复杂,涉及到多个层次不同系统间的相互关联与作用。新的技术手段和分析方法有助于帮助我们进一步了解DNA甲基化的相关机制及其在表观遗传调控中的作用,对其将来的应用也将起到重要的参考作用。