2. 宁波大学海洋学院生物化学与分子生物学实验室,宁波 315211
2. Biochemistry and Molecular Biology Laboratory,School of Marine Science,Ningbo University,Ningbo 315211
Wap65(Warm temperature acclimation related 65 kDa protein)是在硬骨鱼类中普遍存在的一种重要蛋白质,在鱼类生命活动中起着重要的作用。最初通过双向电泳技术在高温驯化的鲫鱼(Carassius auratus)和鲤鱼(Cyprinus carpio)肌肉中检测到Wap65的存在[1, 2]。此后,通过表达序列标签(expressed sequence tags,EST)测序、cDNA文库构建和同源克隆等分子生物学技术,在数种鱼类中发现Wap65存有Wap65-1和Wap65-2两个亚型,包括红鳍东方豚(Takifugu rubripes)[3]、青鳉(Oryzias latipes)[4, 5]、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)[6]、大鳞泥鳅(Misgurnus mizolepis)[7]、香鱼(Plecoglossus altivelis)[8, 9]和牙鲆(Paralchthys olivaceus)[10]。氨基酸序列多重比对分析显示,鱼类Wap65与哺乳动物血红素结合蛋白(hemopexin,HPX)同源,具有与HPX相似的结构特征,包括10个半胱氨酸残基(Cys),可形成5个二硫键,用于维持蛋白结构稳定,以及结合血红素所必需的7个芳香簇氨基酸残基和2个组氨酸残基[7, 8, 9]。基因组结构分析也表明,鱼类Wap65的基因组DNA结构(从起始密码子开始至终止密码子结束)与人HPX结构一致,均由9个内含子和10个外显子组成[3, 5, 6, 9, 10]。
Wap65-2是Wap65的一个亚型。近年来,越来越多的研究揭示,Wap65-2是一个多功能蛋白,不仅参与鱼类的温度适应[6, 11],还与免疫应答[6, 12, 13]、发育[5]、缺氧胁迫[10]和重金属胁迫[14]等多种生理过程密切相关。在养殖鱼类感染病原的研究中,Wap65-2基因mRNA和蛋白均被诱导表达[12, 13]。例如,香鱼感染鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)后,肝组织Wap65-2 mRNA表达上调高达12.0倍,血清Wap65-2蛋白表达量也显著上调[12];花鲈(Lateolabrax japonicus)感染哈维氏弧菌(Vibrio Harveyi)后,肝组织Wap65-2mRNA表达量上调6.89倍,血清中Wap65-2蛋白表达量上调5.33倍[13]。上述研究揭示,Wap65-2参与细菌感染鱼类引起的免疫反应,但具体作用机制未知。Shi[15]构建了香鱼肝组织的酵母双杂交cDNA文库,采用库库筛选技术(library to library screening method,LLS),发现香鱼Wap65-2能与补体系统的核心成份C3相互作用,揭示Wap65-2可能与鱼类补体激活有关。因此,用大黄鱼Wap65-2作为诱饵钓取其相互作用蛋白成为可能。
本研究拟构建大黄鱼(Larimichthys crocea) Wap65-2成熟肽区基因(LcWap65-2m)酵母双杂交诱饵表达载体,检测其在Y187酵母菌中是否具有毒性和自激活作用。研究结果将为利用酵母双杂交技术筛选与Wap65-2相互作用蛋白奠定基础,也为后续相关的抗病育种及病害防治提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料
大肠杆菌TG1菌株、质粒pGBKT7由本实验室保存。pMD19-T Simple Vector、LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、Nde I、BamH I等购自TaKaRa公司(日本)。Gel Extraction Kit购自Omega公司(美国)。SDS-PAGE分子量蛋白标准购自Fermentas (MBI)公司(美国)。酸洗玻璃珠(425-600 μm)购自Sigma公司(法国)。大黄鱼Wap65-2特异性抗体由本实验室保存。二抗(辣根酶标记山羊抗小鼠IgG)购自中杉金桥生物技术有限公司(北京)。ECL化学发光试剂盒、显影定影试剂盒和柯达X-OMAT BT胶片等购自碧云天生物技术研究所(北京)。引物合成及序列测序工作由英维捷基贸易有限公司合成(上海)完成。 1.2 方法 1.2.1 PCR扩增LcWap65-2m cDNA序列
从健康大黄鱼肝组织转录组测序结果中获得LcWap65-2 cDNA序列,随后通过特异性引物扩增、测序验证,确定所获得的序列与转录组测序结果一致(KJ412463)。根据LcWap65-2的成熟肽设计扩增引物,pYTHLcWap65-2F:5'-CCATATGCATGGCGACGCAGGACAT-3'和pYTH-LcWap65-2R:5'-CGGATCCCTAATCCTGACATGACAAC-3'(下划线分别为NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点,斜体字母为保护碱基),以大黄鱼肝组织cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系为25 μL:肝组织cDNA 0.5 μL,上下游引物各1 μL (10 μmol/L),LA Taq 0.25 μL,10×LA buffer 2.5 μL,dNTP 4.0 μL,ddH2O 15.75 μL。PCR反应条件为:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸90 s,30个循环;72℃延伸10 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,预期大小的扩增条带经回收纯化后克隆至pMD19-T simple载体,重组质粒采用ABI3730测序仪进行测序。将测序正确的质粒命名为pMD19-LcWap65-2m。 1.2.2 构建及鉴定诱饵重组质粒
采用NdeⅠ和BamHⅠ将质粒pMD19-LcWap65-2m和pGBKT7双酶切,酶切后将目的基因片段及载体片段切胶回收。将载体片段与目的基因片段利用T4 DNA连接酶连接后转化TG1感受态宿主菌,涂布于含卡那霉素(100 μg/mL)的LB培养基平板,37℃培养过夜。从平板中随机挑选6个单菌落,分别接种于含卡那霉素(100 μg/mL)的LB液体培养基中,200 r/min振荡培养过夜。抽提质粒,PCR初步验证后,用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定阳性克隆,并将阳性克隆送公司测序。将测序正确的重组质粒命名为pGBKT7-LcWap65-2m。 1.2.3 诱饵质粒转化酵母
从-70℃冰箱取出Y187酵母菌株,划线于YPDA平板,30℃培养直至菌落直径2-3 mm。挑取单菌落至1 mL YPDA液体培养基中,振荡将菌块打散,30℃ 250 r/min培养过夜。将过夜培养物全部接种于50 mL新鲜的YPDA液体培养基中,振荡培养至OD600为0.4-0.6。将全部培养物转至离心管中,室温5 000 r/min离心5 min,弃上清,50 mL无菌水重悬菌体,再次离心,弃上清,菌体用1×TE/LiAc溶液(50 μL 1 mol/L LiAc,50 μL 10×TE buffer,400 μL无菌水)重悬浮,即为感受态细胞。向感受态细胞中加入0.1 μg质粒,鲑精DNA 10 μL (0.1 mg),混匀后加入600 μL PEG/LiAc溶液(60 μL 1 mol/L LiAc,60 μL 10×TE buffer,480 μL PEG 3350),高速振荡10 s,将混合物于30℃ 200 r/min培养30 min,加入70 μL二甲基亚砜(DMSO),42℃处理15 min,冰浴2 min,室温14 000 r/min离心5 s,弃上清,菌体用500 μL 1×TE buffer重悬后涂布SD/-Trp平板,培养3-4 d。挑取单菌落,采用菌落PCR法验证质粒是否转化成功。 1.2.4 Western blot检测诱饵质粒在酵母中的表达
挑取平板上新鲜培养直径约1-2 mm的pGBKT7-LcWap65-2m/Y187酵母单菌落至5 mL相应的培养基中,振荡培养过夜。将过夜培养物全部转移到50 mL相应的培养基中,继续培养,直至OD600为0.4-0.6。4℃ 8 000 r/min离心5 min收集菌体,将菌体沉淀重悬于50 mL预冷的无菌去离子水中,再次离心,弃上清。向菌体加入100 μL 60℃预热的裂解液(5 mol/L尿素,5% SDS,40 mmol/L Tris·Cl (pH6.8),0.1 mmol/L EDTA,40 mg/mL嗅酚蓝,1%β-琉基乙醇)、1 μL 0.1 mol/L PMSF和80 μL酸洗玻璃珠,剧烈振荡1 min,70℃水浴10 min,剧烈振荡1 min,然后离心5 min,收集上清,煮沸5-10 min,-30℃保存备用。
将上清样品经5%浓缩胶(100 V,1 h)和12%分离胶(120 V,2 h)电泳,电转移至PVDF膜进行Western杂交,ECL化学发光法检测杂交印迹。将凝胶放置于等面积、甲醇活化的PVDF膜上,然后夹在滤纸中,滤纸上下各3层,湿转法35 V电转移3.5 h。转膜结束后,用10%脱脂奶粉的PBS-T 37℃封闭2 h,加入LcWap65-2抗体(一抗,5% BSA的PBS-T 1:500稀释)4℃孵育过夜。孵育结束后,用PBS-T洗涤PVDF膜,然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG (二抗,PBS-T 1:5 000稀释),37℃孵育1.5 h,洗涤后加上ECL于暗室显影、定影。扫描仪扫描蛋白条带。 1.2.5 诱饵质粒毒性检测
挑取pGBKT7-LcWap65-2m/Y187单菌落(直径2-3 mm)至50 mL SD/-Trp/Kan(20 μg/mL)培养基中,30℃振荡250 r/min培养24 h后,检测OD600,若OD600≥0.8,说明融合蛋白BD-LcWap65-2m对酵母无毒性作用,反之有毒性。 1.2.6 诱饵质粒自激活检测
将pGBKT7-LcWap65-2m/Y187菌悬液涂布于SD/-Trp/X-α-gal、SD/-His/-Trp/X-α-gal和SD/-Ade/-Trp/X-α-gal平板上,30℃培养3-5 d,观察生长情况和颜色反应。 2 结果 2.1 LcWap65-2m的PCR扩增
以健康大黄鱼肝cDNA为模板,以带酶切位点的诱饵载体构建引物扩增LcWap65-2m,结果获得大小约1 240 bp左右的特异性条带(图 1),与预期大小相符。
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| 图 1 LcWap65-2m基因的PCR扩增 |
PCR和双酶切验证结果(图 2)表明,目的片段已插入pGBKT7载体中,将构建成功的载体命名为pGBKT7-LcWap65-2m。测序结果也表明,目的片段已按正确的框架插入pGBKT7中,且未发现核苷酸缺失和突变现象。
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| 图 2 重组质粒pGBKT7-LcWap65-2m双酶切及PCR鉴定 |
采用菌落PCR法对酵母转化子诱饵质粒进行PCR验证,结果(图 3)显示,6个酵母转化子均能扩增出1 240 bp左右的特异性条带,与预期大小相符,表明pGBKT7-LcWap65-2m转化Y187菌株成功。
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| 图 3 酵母转化子pGBKT7-LcWap65-2m/Y187 PCR验证 |
挑取Y187以及转有诱饵载体pGBKT7-LcWap-65-2m的Y187单菌落扩大培养后,提取酵母总蛋白,用制备的LcWap65-2特异性抗血清检测诱饵载体在Y187中的表达。理论上,pGBKT7空载体的DNA结合结构域(147个氨基酸)和部分载体序列编码的氨基酸(28个氨基酸)与LcWap65-2(46.75 kD)连接成融合蛋白(BD-LcWap65-2m),计算分子量约为66.0 kD。Western blot检测结果(图 4)显示,未转化质粒的Y187总蛋白无特异条带,转化有诱饵载体的酵母总蛋白有特异性条带出现,而且条带大小与预期相符,表明诱饵蛋白LcWap65-2m在Y187中稳定表达,并具有免疫活性。
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| 图 4 Western blot分析诱饵蛋白LcWap65-2m在Y87中的表达 |
挑取pGBKT7-LcWap65-2m/Y187单菌落(直径约为2-3 mm)至50 mL SD/-Trp/Kan (20 μg/mL)培养基中,30℃振荡培养(250 r/min)24 h,测得菌液OD600为1.31,符合进一步进行酵母双杂交实验所要求的≥ 0.8。结果表明,诱饵蛋白LcWap65-2m对酵母菌株Y187无毒性作用。 2.6 诱饵蛋白LcWap65-2m的自激活鉴定
将pGBKT7-LcWap65-2m/Y187涂布于SD/-Trp/X-α-gal、SD/-His/-Trp/X-α-gal和SD/-Ade/-Trp/X-α-gal平板上,30℃培养3-5 d,观察到pGBKT7-LcWap65-2m/Y187能在SD/-Trp/X-α-gal平板上生长但不显蓝(图 5-A),在SD/-His/-Trp/X-α-gal和SD/-Ade/-Trp/X-α-gal平板均不能生长(图 5-B,C)。结果表明,诱饵质粒表达的诱饵蛋白LcWap65-2m无自激活特性,不能自激活Y187的报告基因。
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| 图 5 诱饵蛋白LcWap65-2m自激活作用检测 |
酵母双杂交技术是利用杂交基因通过激活报告基因的表达探测蛋白与蛋白的相互作用,被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域,已成为现代分子生物学研究领域一个很重要的实验手段[16, 17]。目前,酵母双杂交技术在水产动物免疫蛋白筛选、病原与宿主蛋白互作等研究中也得到较为广泛的应用。例如,Chen等[18]以香鱼白细胞衍生趋化因子2(Leukocyte cell-derived chemotaxin 2,LECT2)为诱饵,利用酵母双杂交技术从香鱼肝组织cDNA文库筛选到2个与LECT2互作的蛋白,分别为C型凝集素受体(C-type lectin receptor)和转铁蛋白(Transferrin);李杰等[19]利用酵母双杂交系统筛选到2个与草鱼呼肠孤病毒NS38相互作用的蛋白,其中1个为40S核糖体蛋白的S16亚基。本研究使用Clontech公司的Gal4酵母双杂交系统,能提供更为严格的报告基因筛选方法,具有转化效率高、假阳性率低的优点。
本实验成功构建了LcWap65-2m的酵母双杂交诱饵载体,将其转化Y187酵母菌,结果发现pGBKT7-LcWap65-2m/Y187能在SD/-Trp平板上生长,直径达1.5-2.0 mm。由于某些蛋白自身能够结合转录激活因子从而直接激活报告基因的表达,本实验验证了诱饵蛋白LcWap65-2m的自激活作用,结果表明,pGBKT7-LcWap65-2m/Y187在SD/-Trp/X-α-gal平板上能生长但不显蓝,在SD/-His/-Trp/X-α-gal和SD/-Ade/-Trp/X-α-gal平板上不生长,表明诱饵蛋白未激活酵母报告基因,无法分解X-α-gal,无自激活活性。此外,由于某些蛋白质的表达对酵母菌株可能产生一定的毒性作用,本实验测定了pGBKT7-LcWap65-2m/Y187单菌落在SD/-Trp/Kan培养基中振荡培养24 h后菌液的吸光值,结果OD600大于0.8,表明融合蛋白对Y187无毒性作用。因此,本实验构建的pGBKT7-LcWap65-2m诱饵质粒满足检测蛋白质相互作用的需要,后续通过酵母双杂交系统可进一步研究其与上下游分子间的交互作用,为研究Wap65-2在免疫应答中的生物学功能奠定了基础。 4 结论
本研究成功构建了酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-LcWap65-2m,该诱饵质粒能够在酵母细胞中成功表达融合蛋白,且无自激活作用和毒性作用。研究结果为进一步利用酵母双杂交技术筛选与Wap65-2相互作用的蛋白奠定基础。
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