烟草制品作为特殊消费品，公众对转基因烟草比其他转基因作物更加敏感，烟草作为转基因研究的模式植物，国内外很多科研单位已成功培育抗虫、抗病等多种表现优异的转基因烟草^[1]，这些实验材料一旦发生不规范释放和利用，将对消费者利益和我国烟草制品的国际形象造成重大影响。

国际上对烟草转基因检测的遗传元件主要为35S启动子（烟草花叶病毒CaMV 35S启动子）、NOS终止子（农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子）、NPT II筛选标记基因（来自大肠杆菌，编码新霉素磷酸转移酶，卡那霉素抗性的标记基因）^{[1, 2]}，我们在对烟草转基因研究中常用遗传元件的筛查中^[1]，统计出这3种元件在烟草转基因研究中的使用频率为90%，属于高频使用外源基因元件，在我国，GB/T24310-2009 《烟草及烟草制品 转基因检测方法》^[3]将这3种遗传元件作为转基因烟草检测中共有序列标志。因此，在检测烟叶中是否含有转基因成分时，可先行检测35S、NOS、NPT II基因是否存在来确定烟叶中是否含转基因成分。而NR基因为烟草内源基因硝酸还原酶，在PCR检测中用以评价DNA提取质量的可用性^[4]。

在转基因检测方法中，PCR方法以其灵敏度高而得到广泛认可，定性PCR技术是转基因检测中最成熟的技术之一，并且多数国家将该方法制定为标准检验方法，但是，大多数定性PCR检测采用单一PCR技术，需分别对每个靶标进行检测，花费时间较多^[5]。多重PCR方法是单一PCR方法的改进，该技术在一次PCR反应中同时加入多对引物，只需一次PCR反应便能同时检测两种以上靶标序列，较单一PCR更为快捷和经济^[6]，在病毒检测、细菌检测、转基因检测中得到广泛应用^[7]。高玉龙等^[8]曾提出用于转基因烟草检测的多重PCR方法，但该方法是将35S与NR，NPT II与NOS分别进行二重PCR检测，并未在同一反应内同时实现4种基因成分的检测。本实验以烤后烟叶为供试材料，旨在建立通过一个PCR反应内便能同时检测烟草内源基因NR、外源基因35S启动子、NOS终止子及NPT II筛选标记基因的多重PCR方法。

转基因阳性烤后烟叶，非转基因烤后烟叶由本实验室研制提供，其中转基因阳性烟叶为T3代Southern检测单拷贝阳性植株，含NPT II、35S、NOS三种已知转基因成分。烤后烟叶DNA提取参照GB/T 24310-2009 《烟草及烟草制品 转基因检测方法》^[3]，DNA浓度统一调至100 ng/μL后，转基因烟叶DNA与非转基因烟叶DNA按1∶99（V/V）比例混合，制成转基因含量为1%的供试DNA。

rTaq^TM（货号R001A，内含A试剂：dN-TP mixture，浓度为各2.5 mmol/L，B试剂：10×PCR buffer，Mg²⁺浓度为15 mmol/L，C试剂：rTaq酶，5 U/μL）、100 bp DNA Ladder Marker、6×Loading Buffer为TaKaRa公司产品，核酸染料GelRed^TM 10 000×in water为BIOTIUM公司产品。

参照国标^[3]引物在NCBI中检索基因原序列，通过Primer Premier V5.0设计引物，用软件中的Multiplex/Nested Primers功能，筛选出引物间干扰最小的引物组合，再利用Olige 6.0对设计引物Tm值进行评估，确定最终引物序列，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表 1 引物序列及扩增产物

表选项

单一PCR反应体系为：10×PCR buffer 2 μL（Mg²⁺终浓度1.50 mmol/L），dNTP 1 μL（dNTP终浓度125 μmol/L），上下游引物各1 μmol/L，DNA模板1 μL，rTaq酶0.2 μL，ddH2O补足20 μL。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30，65℃退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物加5 μL 6×Loading Buffer，取8 μL经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

以上述单一PCR体系为初始反应体系，将4对引物稀释成相等摩尔浓度后预先按1∶1∶1∶1（V/V）混合，对Mg²⁺、dNTP、rTaq酶和混合引物浓度进行优化，Mg²⁺浓度：0.75、1.50、2.25、3.00、3.75和4.50 mmol/L；dNTP浓度：100、125、150、175、200、225、250和275 μmol/L；rTaq酶浓度：1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 U；混合引物浓度：0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00 μmol/L。反应体系均为20 μL。PCR产物加5 μL 6×Loading Buffer，取8 μL经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

根据1.2.3优化的反应体系，分别对退火温度和循环数进行优化。退火温度梯度：57.5、60.0、62.5、65.0和67.5℃；循环数：27、29、31、33和35个循环。反应体系均为20 μL。PCR产物加5 μL 6×Loading Buffer，取8 μL经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

根据1.2.3及1.2.4优化后的多重PCR反应体系及条件，按1.1.1将转基因烟叶DNA及非转基因烟叶DNA混合为转基因成分含量分别为0.9%、0.7%、0.5%、0.3%和0.1%的DNA样品，确定多重PCR的检测限。

对转基因及非转基因烟叶内源基因NR的扩增结果（图 1）显示，在137 bp处有明显的特异性扩增条带，说明提取的烟叶DNA模板可用于PCR检测。对外源基因NPT II、35S、NOS的扩增结果可知，转基因烟叶分别在约490 bp、345 bp和199 bp处出现明显的特异性扩增条带，而非转基因烟叶未见扩增条带，且空白对照均无条带，说明本实验设计的引物具有较好的特异性，符合PCR检测需要，可用于下步的多重PCR检测试验。

M：100 bp Ladder DNA Marker，；1-3、4-6、7-9、10-12分别为NPT II筛选标记基因、35S启动子、NOS终止子、NR基因的单一PCR产物，其中1、4、7、10为转基因含量1%烤后烟叶DNA，2、5、8、11为非转基因烤后烟叶DNA对照，3、6、9、12为空白对照 图 1 单一PCR扩增结果

图选项

在加入不同浓度的Mg²⁺后，转基因烟叶多重PCR反应扩增结果（图 2）显示，泳道2中，在Mg²⁺浓度为1.5 mmol/L时，4个基因的扩增条件亮度较为一致且清晰可见，而泳道1及泳道6中，Mg²⁺分别为0.75 mmol/L及4.5 mmol/L时，反应条带非常很弱，基本不可见，而其他泳道中不同Mg²⁺浓度的扩增效果均没有泳道2理想，说明10×PCR buffer中Mg²⁺对多重PCR反应影响显著，在Mg²⁺浓度为1.5 mmol/L时扩增效果最佳。图 3结果所示，在泳道1-7中，不同dNTP浓度的扩增条带亮度均较为一致，无显著的非特异性扩增条带，但是，当dNTP浓度达到275 μmol/L时，NPT II及NR基因特异扩增条带可见，但35S及NOS反应条带亮度明显很弱。图 4及图 5中，rTaq酶浓度及混合引物浓度在一定范围内的变化并未对结果有显著影响，但rTaq酶浓度偏高时，在约600 bp处有非特异性扩增条带出现。

M：100 bp Ladder DNA Marker；1-6：Mg2+浓度分别为0.75、1.50、2.25、3.00、3.75和4.50 mmol/L 图 2 多重PCR中不同Mg2+浓度扩增结果

图选项

M：100 bp Ladder DNA Marker；1-8：dNTP浓度分别为100、125、150、175、200、225、250和275 μmol/ 图 3 多重PCR中不同dNTP浓度扩增结果

图选项

M：100 bp Ladder DNA Marker；1-5：rTaq酶浓度分别为1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 U 图 4 多重PCR中不同rTaq酶浓度扩增结果

图选项

M：100 bp Ladder DNA Marker；1-7：混合引物浓度分别为0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00 μmol/L 图 5 多重PCR中不同混合引物浓度扩增结果

图选项

综合以上因素、实验成本及单一PCR扩增结果，优化后的反应体系为4对引物预先稀释成相等摩尔浓度后按1∶1∶1∶1（V/V）混合，在反应中加入Mg²⁺ 1.5 μmol/L、dNTP 125 mol/L、rTaq 1 U、混合引物1 μmol/L。

图 6中，退火温度为65℃时扩增效果最佳，而65℃以下退火温度的扩增效果均不理想，部分条带不清晰，而退火温度为67.5℃时，35S及NOS的特异性扩增条件不可见，这是由于在较高退火温度条件下这两对引物的Tm值较低所致。图 7中，35个循环的反应条件为最佳循环数。

M：100 bp Ladder DNA Marker；1-5：退火温度分别为57.5、60.0、62.5、65.0和67.5℃ 图 6 多重PCR中不同退火温度扩增结果

图选项

M：100 bp Ladder DNA Marker；1-5：循环数分别为27、29、31、33和35个循环 图 7 多重PCR中不同循环数扩增结果

图选项

根据2.2及2.3的多重PCR优化结果，最终确定该反应的最优条件为：体系中加入Mg²⁺ 1.5 mmol/L、dNTP 125 μmol/L、rTaq酶 1 U、混合引物1 μmol/L，DNA 100 ng。反应条件为：退火温度为65℃，循环数35个。为确定本体系的检测限，设置了转基因含量分别为0.9%、0.7%、0.5%、0.3%和0.1%的多重PCR检测，图 8中结果所示，在转基因烟叶含量为0.9%的反应体系中，烟草内源基因NR及3个外源基因均得到有效扩增，但在0.7%含量以下时，外源基因目的条带并不明显。因此，该多重PCR反应体系检测限为0.9%。在本体系中，若内源基因NR得不到有效扩增，则表明所提取的烤后烟叶DNA可能含有PCR反应抑制物，即外源基因无特异扩增条带时也不能说明该样品便是转基因阴性的。

M：100 bp Ladder DNA Marker；1-5：烟叶转基因成分含量分别为0.9%、0.7%、0.5%、0.3%和0.1%；6：非转基因烟叶 图 8 多重PCR中转基因含量检测限扩增结果

图选项

多重PCR是在同一体系中加入多对引物进行扩增，不同引物浓度及比例、Mg²⁺、dNTP等都会对PCR结果造成不同程序的影响，因此设计引物时要充分考虑各引物扩增片段大小、相互干扰、退火退度等，在选择引物时需用分子生物学软件进行筛选，同时需要对反应体系及条件进行优化^[9]，由于烤后烟叶DNA降解严重，DNA提取质量是PCR检测的关键^[10]，否则会得到假阴性结果，因此用多重PCR检测烤后烟叶转基因成分时，有必要对内源基因同时进行PCR扩增，我们选择了烟草内源硝酸还原酶基因NR作为内源参照基因^[3]，以判断所提取DNA是否适于PCR反应。

本实验所建立的多重PCR体系为定性检测，在烤后烟叶转基因检测中具有较好的复重性和稳定性，检测极限为0.9%，而在有关多重定性PCR检测转基因作物的报道中^{[11, 12]}，仅对所测靶标进行定性检测，并未明确提出其检测限，在提到检测限的文献中，邱良焱等^[5]所建立的多重PCR体系检测限为0.9%，Guo等^[13]检测限为80个拷贝，烟草的基因组约10 pg DNA^[14]，按此推算，本实验检测灵敏度为90个拷贝，与其他学者的检测极限基本相符。

值得指出的是，使用不同的阳性对照材料对检测极限会有不同极限值，本实验中所使用的转基因阳性烟叶为T3代，Southern检测为单拷贝的材料，但在严格的外源转基因检测中，用于定量的阳性植物材料应是拷贝数单一且稳定，不显示等位基因变化的DNA序列来作为阳性对照^[15]，因此，在目前尚未有烤后烟叶转基因PCR检测标准物质的情况下，本实验中的检测极限还需多家单位进行协同实验。

以烤后烟叶为材料，建立了在一个PCR反应管内便能同时检测烟草内源基因NR、外源基因35S启动子、NOS终止子及NPT II筛选标记基因的多重PCR方法，初步建立的体系检测限为0.9%（V/V），为烤后烟叶转基因成分筛查提供了技术支撑。