西瓜枯萎病俗称蔓割病或萎蔫病，是由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）引起的一种世界性瓜类土传病害^{[1, 2, 3]}。它的发生极为普遍，对西瓜产量和品质构成了严重的威胁，是西瓜生产上的重要病害。目前，对这类维管束病害的有效防治方法主要是依靠抗病品种选育，但可供选育的抗病品种抗源单一，效率不高。赵丽明等^[4]从西瓜根际土壤中筛选出对西瓜枯萎病菌防治效果好、无污染土壤中生存良好的放线菌菌株XF9、XF18和XF22，能较好的防治西瓜枯萎病。3种有益微生物为生物农药的研发奠定了基础，也为西瓜枯萎病上拮抗菌的拮抗机制奠定了理论基础。国际上公认的西瓜枯萎病菌有3个生理小种，即生理小种0号、1号和2号，其中2号生理小种的侵染性最强^{[5, 6, 7]}。除以上3个生理小种外，还有其他的小种分化，生理小种3于2010年鉴定分离^[8]，但在中国尚未见报道，需进一步证实。传统上对西瓜枯萎病菌的鉴定主要是采用形态特征的比较法，即对不同地区的西瓜枯萎病菌分离物进行形态特征（如菌落颜色、菌落密度、大小孢子的大小与形状及菌落直径等）的比较。但利用传统的鉴定方法来鉴别病原菌准确性不高，已不能满足生产的要求。近年来，随着分子生物学技术的发展，包括AFLP、RFLP、RAPD及SCAR在内的分子检测技术在病原菌鉴定^[9]、分类^[10]及群体遗传多样性^[11]研究中得到植物病理学家的高度重视。基于特异基因组设计的特异性引物已经广泛应用于病原菌的分子检测，前人基于特异性引物成功建立了快速检测双重PCR技术已用于检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌^[12]、小麦条纹花叶病毒和小麦花叶病毒^[13]等植物病原菌的分子鉴定体系。目前在尖孢镰刀菌的分子检测方面，Zhang等^[14]利用甘蓝枯萎病菌特异性引物Focs-1/Focs-2和尖孢镰刀菌通用引物W106R/W106F建立了检测甘蓝枯萎病菌的多重PCR检测体系。该技术既可应用于甘蓝枯萎病发病区病情的检测，也可从发病植株中检测出甘蓝枯萎病菌。而对于西瓜枯萎病菌的分子检测，Zhang等^[15]把西瓜枯萎病菌和西瓜蔓枯病菌的2对特异性引物Fn-1/Fn-2 和Mn-1/Mn-2置于同一反应中，建立了检测西瓜枯萎病菌和蔓枯病菌的双重 PCR 体系。但双重PCR检测西瓜枯萎病菌和其他病原菌的方法在国内外都未见报道。

本研究拟通过设计西瓜枯萎病菌的特异引物，与尖孢镰刀菌的通用引物W106R/W106S结合，建立双重PCR检测体系，对西瓜枯萎病菌、尖孢镰刀菌其他专化型菌株和其他外围菌株进行专化性检测，以期为该病的预测预报并及时采取有效的防控措施提供依据。

本研究供试菌株包括西瓜枯萎病菌的3个小种共7个菌株、尖孢镰刀菌其他专化型的10个菌株和其他5个外围菌株。其种名、来源及数量，见表 1。

表 1 供试西瓜枯萎病菌菌株的来源

表选项

西瓜枯萎病菌在PDA培养基上（28℃）培养72 h后，从菌落的边缘挑取菌丝转至PDB液体培养基中（150 r/min，28℃）振荡培养3 d过滤收集菌丝，-80℃保存备用。

用改良的CTAB法^[16]提取病原菌的DNA。

根据西瓜枯萎病菌的基因组序列，比对近缘种以及其他不同致病菌的序列同源性，通过基因组BLAST的方法找到西瓜枯萎病菌的特异片段。用引物设计软件Primer 5.0设计出10对引物，详况，见表 2。

表 2 待筛选的生物序列

表选项

引物检测西瓜枯萎病菌的PCR反应总体系是25 μL：2×Taq Master Mix（Dye Plus）12.5 μL，10 μmol/L的引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O 8.5 μL。PCR的反应程序是：94℃预变性4 min；94℃变性40 s；60℃退火30 s；72℃延伸100 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min。扩增结束后，取6 μL PCR产物经1%（50×TAE）琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪上观察并拍照。

用合成的引物对供试菌株的基因组DNA进行扩增，检测其特异性，PCR反应体系、反应程序同上。

利用设计的检测西瓜枯萎病菌的特异性引物与尖孢镰刀菌其他专化型菌株的通用引物W106R/W106S^[17]结合，建立双重PCR体系。通用引物W106R/W106S的序列为W106R（5'-GCAGTCGTACGTCATCGACC-3'）和W106S（5'-CCATGGCAGATGGCGAGTCA-3'），该引物使尖孢镰刀菌其他专化型菌株扩增出一条729 bp的特异性条带^[17]。

双重PCR反应总体系为25 μL：2×Taq Master Mix（Dye Plus）12.5 μL，西瓜枯萎病菌的特异引物（10 μmol/L）各1 μL，通用引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O 6.5 μL。PCR反应程序：94℃预变性4 min；94℃变性40 s；60℃退火30 s；72℃延伸100 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min。扩增结束后，取6 μL PCR产物经1%（50×TAE）琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪上观察并拍照。

利用设计的10对西瓜枯萎病菌特异性引物对供试的7个西瓜枯萎病菌菌株的DNA进行PCR扩增。结果（图 1）显示，只有1、2、3、4和6号引物均可以产生比较单一的条带，而其他的引物则不能产生单一的条带，说明上述5对引物均具有较强特异性。

1-7，9-15 ：西瓜枯萎病菌菌株 ；8，16 ：阴性对照 ；M ：2K Plus 分子量标记 图 1 利用编号为1至10的引物和通用引物 W106R/W106S 扩增的特异性条带

图选项

对筛选出的5对引物和供试的7个西瓜枯萎病菌菌株、10个尖孢镰刀菌其他专化型菌株和5个外围菌株的DNA进行PCR扩增，以ddH₂O为对照。结果显示，1、2、3、4和6号引物可以使西瓜枯萎病菌产生相应的单一条带（图 2，泳道1-7），而在尖孢镰刀菌其他专化型菌株和外围菌株中均不能产生条带（图 2，泳道8-22）。通用引物可以使西瓜枯萎病菌和尖孢镰刀菌其他专化型菌株扩增出729 bp的条带（图 2，泳道1-17），表明上述引物均具有特异性。

1-7 ：西瓜枯萎病菌菌株 ；8-17 ：尖孢镰刀菌其他专化型菌株 ；18-22 ：外围菌株 ；23 ：阴性对照 ；M ：2K Plus 分子量标记 图 2 利用编号为 1、 2、 3、 4、 6 的引物和通用引物W106R/W106S 扩增的特异性条带

图选项

以5对特异性引物和通用引物（W106R/W106S）对7个西瓜枯萎病菌菌株以及15个对照菌株的基因组DNA进行双重PCR扩增，以ddH₂O为对照。PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果如图 3所示，西瓜枯萎病菌可以产生两条不同的条带（图 3，泳道1-7，1-17），尖孢镰刀菌其他专化型菌株只产生一条729 bp的条带（图 3，泳道8-17），而外围菌株和无菌水不能扩增出条带（图 3，泳道18-23）。研究结果显示，双重PCR检测结果与常规PCR检测结果一致，也进一步证明双重PCR检测技术的可靠性。

1-7 ：西瓜枯萎病菌菌株 ；8-17 ：尖孢镰刀菌其他专化型菌株 ；18-22 ：外围菌株 ；23 ：阴性对照 ；M ：2K Plus 分子量标记 图 3 利用编号为 2、 3、 4、 6 的引物和通用引物 W106R/W106S 扩增的特异性条带

图选项

双重PCR（Duplex PCR）是在一个PCR反应体系中加入两对特异性引物，同时扩增2个目的基因，能够在一个PCR反应中检测出两种病原菌，提高效率，而且还可以减少因实验操作所带来的假阳性等问题，能很好地用于植物病原菌间的检测。建立双重 PCR 体系的关键是引物设计^[18]，双重PCR反应中引物之间不可以发生相互作用，形成引物二聚体和非特异性的扩增。同时，二者扩增的片段长度要有一定的差距，电泳检测可以产生不同的条带。因此，双重PCR体系的建立很重要^{[19, 20]}。

检测不同植物病原菌的双重PCR反应在国内外均有报道，如陈庆河等^[21]利用马铃薯晚疫病菌内转录间隔区序列设计了一对特异性引物INF1/INF2，与马铃薯青枯病菌特异性引物 759/760 组合建立双重 PCR 体系。Diallo 等^[22]建立了检测胡萝卜软腐果胶杆菌马铃薯黑胫病亚种和菊亚种的双重 PCR体系，能够快速的对两种病原菌进行分子检测。Majumder 等^[23]建立了检测洋葱黄矮病毒和葱潜隐病毒的双重 PCR 体系，该体系是在 RNA 水平上对洋葱黄矮病毒和葱潜隐病毒进行检测。

前人应用双重PCR方法只能检测出西瓜枯萎病菌和西瓜蔓枯病菌，而针对西瓜枯萎病菌与尖孢镰刀菌其他专化型的病原菌和其他病原菌的分子检测尚未报道。在本研究中，通过对西瓜枯萎病菌的全基因组测序，比对近缘种以及瓜类上几种重要病原菌的基因组序列，设计并筛选能扩增出西瓜枯萎病菌特异性DNA条带的引物。本研究设计的特异引物能够快速而准确的检测西瓜枯萎病菌，在西瓜枯萎病菌潜伏期和发病初期对其进行诊断、监测和病原菌鉴定，以便采取有效的防治方法，及时控制病害的传播和蔓延，减少经济损失，在实际生产上具有重要的指导作用。双重PCR具有效率高、成本低等优点，具有非常广阔的实际应用价值，同时本研究也为其他植物病害双重PCR检测方法的建立奠定了理论基础。

本研究建立了一种双重PCR检测体系，通过设计和应用引物Fon-2R/ Fon-2F、Fon-3R/ Fon-3F、Fon-4R/ Fon-4F 和Fon-6R/ Fon-6F能检测出西瓜枯萎病菌。该检测体系具有高效、准确及经济实惠等优点，适用于西瓜田间土壤的带菌检测以及西瓜枯萎病菌的检验检疫和有效防治。