红豆杉,别名紫杉、赤柏松,属红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus),常绿乔木或灌木^{[1, 2]},为第四世纪冰川后遗留古老孑遗植物,全世界自然分布极少,1994年被列为国家一级重点保护植物,有"植物大熊猫"之称^[3]。因其能产生具有独特抗癌机制的次生代谢产物--紫杉醇^[4],且可以不间断释放氧气^[5],红豆杉具有很好的药用特性和保健作用;同时也是一种很好的观赏性植物,其木材更可用于建筑、家具制造、雕刻等用途。

红豆杉主要用于从中提取紫杉醇及其衍生物,虽然已开发出多种紫杉醇药源生产方法,如化学合成/半合成法、微生物发酵法、细胞工程及基因工程技术等,但受限于投入成本过高、生产工艺复杂以及产紫杉醇效率低下等条件的限制,植株栽培仍是当前最为经济、稳定、有效的方法。本文就红豆杉生物学特性、境内分布和林业培育技术作如下综述。 1 红豆杉的生物学特性及分布

红豆杉树种为常绿乔木或灌木,小枝不规则互生,属典型浅根植物,主根不明显,侧根发达。雌雄异株,异花授粉,球花小,单生于叶腋。雄球花具柄、基部有鳞片,呈头状;雌球花胚珠顶生,基部有珠托,呈盘状,下部有苞片,数枚;种子坚果状,球形,生于杯状肉质的假种皮中,成熟时肉质假种皮红色^{[6, 7]}。

红豆杉属植物是典型的阴性树种,对气候的变化,特别是对温度、光照和湿度的要求较严。在偏酸性、排水良好,湿润、松散、肥沃的土壤上生长良好。幼苗喜阴、忌晒,育苗及移植第一年需遮阴管理。成熟林常见于乔木林下第二、三层,多为散生,极少有大面积天然纯林存在。红豆杉生长缓慢,寿命长,是典型的慢生树种,100年以上树龄的红豆杉胸径仅40 cm。幼树和成树在冠层郁闭度0.5-0.6条件下长势良好,随郁闭度增加,长势减弱。红豆杉萌发力强,耐修剪,耐寒。天然更新方式为种子繁殖和无性萌芽繁殖。受限于散生分布及结种数量少、种皮厚、休眠期长的特点,红豆杉天然更新能力弱^[8]。

中国本土红豆杉有4个种1变种^[9],即东北红豆杉(Taxus cuspidata Sieb et Zucc),云南红豆杉(Taxus yunnanensis),南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei),喜马拉雅红豆杉(Taxus wallichiana),中国红豆杉(Taxus chinensis),分布于我国西南、东北、东南及台湾等地。其林业分布及主要生物学特性,如表1所示。

表 1 中国红豆杉林业分布及其主要生物学特性

表选项

红豆杉有性繁殖技术即播种,成熟的红豆杉种子因其休眠期较长,自然条件下需经两冬一夏连续14个月左右的湿沙储藏后方可播种发芽。播种前经适当处理,可大大缩短促后熟周期,其一般步骤为:先机械磨损或化学腐蚀种皮,破除蜡质和栓质层对水分和氧气的阻隔作用;再经水浸、湿沙层或变温层积处理,解除胚轴休眠^[23];最后经催芽、消毒、清洗等处理后即可进行田间播种育苗。

采用有性繁殖技术时常用的破除休眠方法为变温层积处理,张志权等^[24]在处理云南红豆杉种子时,先磨破种皮,再在25℃暖温中层积36周后继续在5℃低温中层积12周,种子发芽率可达74.9%。同时研究发现,层积前激素预处理对种子萌发并无明显促进作用。吉前华^[25]处理南方红豆杉种子的技术流程则为:先用60%浓硫酸腐蚀种皮3 h,再经100 mg/L GA3+10 mg/L 6-BA的水溶液浸泡24 h,最后在珍珠岩作层积基质上作9个月的25℃暖温层积和3个月的5℃低温层积,发芽率可达36.1%。Liu等^[26]通过比较研究后认为300 mg/L的GA浸泡2 d加浓硫酸腐蚀1min的前处理方式结合变温层积处理是解除南方红豆杉种子休眠的最佳组合,并且确定长链脂肪酸是影响种子萌发的主要抑制物质。

李秋琦等^[27]则通过测定不同层积阶段南方红豆杉种子生理生态指标的变化,以期揭示南方红豆杉种子休眠及其解除的机理。其处理种子流程为:300 mg/L的GA 2 d→浓硫酸1min →湿沙混匀→ 4℃层积3个月→ 25℃层积3个月→ 4℃层积150 d。在分析了可溶性糖、淀粉、蛋白质、脂肪及淀粉酶活性的变化规律后认为,在"冷-热-冷"变温层积过程中,解除南方红豆杉种子休眠的关键在于脂肪酸的分解与转化,这些被利用的脂肪除了为种胚形态形成提供物质和能量外,还可能导致了种子萌发抑制物的降解。 2.2 无性繁殖 2.2.1 组培成苗技术

采用植物组织培养技术获得完整植株有两条途径:器官发生途径和体细胞胚发生途径,现有红豆杉组培成苗技术成果全部属于器官发生途径,而器官发生途径又可分为直接发生和间接发生途径,前者指由外植体直接诱导成苗,后者指外植体经诱导成愈伤组织再分化成苗。 2.2.1.1 外植体直接诱导成苗

选择具有初生分生能力的红豆杉组织(嫩枝、顶芽、腋芽、茎尖、离体胚等),经体外培养可直接诱导发芽或生根,形成完整植株^[28]。影响外植体芽诱导效率的因素主要有种属、取材季节、部位、培养基配比、外源激素浓度,常选用WPM、B5、MS、DCR等作基本培养基,为防止褐变,可添加0.2%-0.5%的活性炭粉(AC)。以枝条为外植体时,多选用处于生长旺盛期或长有营养芽的嫩枝,这样有利于茎芽的诱导增殖。激素配比对诱导结果影响较大,但遵循愈伤组织诱导基本规律,即:分裂素高有利于出芽,而生长素高则有利于生根。目前尚未见系统的诱导红豆杉外植体生根发芽最佳条件的报道,研究结果主要集中于芽的诱导,如用TIBA (2,3,5-三碘苯甲酸)诱导南方红豆杉新梢,3.0 mg/L时诱导率可达100%,另外单独添加0.1 mg/L ZT和0.01 mg/L 6-BA时效果也十分理想^[29];而关于红豆杉外植体诱导生根方面的研究则不如芽诱导那么丰富,当前技术只能保证可以诱导出不定根,如喜马拉雅红豆杉的枝条在添加3.5 mg/L IBA的MS和8 mg/L IBA的1/2 MS培养基上培养,60-80 d后可诱导生根^[30]。总的来说,分裂素浓度控制在1-4 mg/L利于出芽^[31],而生根则受外植体树龄和IBA影响较大,且诱导生根困难,最好选用幼龄树枝^[32]。

影响红豆杉外植体芽诱导发生的因素较多,有种的原因,也有外植体选择部位与季节的原因,培养基的配方则更为重要,特别是外源生长调节剂的量和种类的选择,较难把握,其是否与植物内源激素有关,现在还不清楚。因此,在进行芽诱导前对外植体内源激素进行分析研究,对降低外源生长调节剂添加的盲目性、提高诱导的成功率具有重要意义。 2.2.1.2 离体胚

离体胚是一类特殊的外植体,它取材于成熟或未成熟的红豆杉种子,从中分离出胚/胚性组织,再经体外培养以获得完整植株的技术。其基本流程为:种子先进行简单的预处理,然后在无菌条件下去外种皮,再经化学消毒杀菌、剥离出胚性组织,最后置于培养基上培养。

关于红豆杉离体胚培养研究起步较早^[33],对不同种类的红豆杉国内外均有研究,尤以南方红豆杉、东北红豆杉、云南红豆杉和欧洲红豆杉^{[33, 34, 35, 36]}的研究成果较为丰富。

种子的预处理方式主要包括流水冲洗和低温处理,流水冲洗应用较早。1994年,Zhiri等^[34]将胚性组织从欧洲红豆杉(Taxus baccata L.cv.Stricta)种子中剥离之前,先以流水冲洗7 d,后置于含0.5%活性炭(AC)的改良MS和Heller培养基中,培养7 d后离体胚萌发率达100%,张长河等^[35]也以南方红豆杉种子为对象进行了类似的研究发现,种子经流水冲洗9 d以上,所得离体胚经10 d的离体培养,萌发率可达100%,并认为种子在自来水中反复冲洗有利于种胚的萌发,并推测可能的原因是冲冼去除了胚及胚乳内抑制萌发的物质(如ABA)。低温处理为播种培育前处理常用方法,也可应用于离体胚培养,如臧新等^[36]采用4℃低温处理成熟的南方红豆杉种子30 d,其萌发率可达69.10%;同时与流水冲洗预处理对比,发现长时间(>4 d)的冲洗对种胚的萌发不利,并对流水冲洗有利于萌发的传统解释提出质疑。另外还指出,长时间的水冲洗会使胚乳呈现粉糊状,给消毒、胚乳剥离工作造成一定的困难,且易被污染。

种子经去种皮后还需经消毒杀菌处理,常用消毒剂有70%乙醇、0.1%升汞、0.125% NaClO等。杀菌处理后即可从中剥离出胚性组织,关于胚乳的去留,当前研究者基本倾向于去除胚乳更有利于萌发,但并不绝对,如朱念德等^[37]通过对南方红豆杉种胚离体培养发现,冷层积的种子在含2 mg/L 6-BA的培养基上培养时,带胚乳的离体胚的萌发率比不带胚乳的高出22.05%,达72.15%,同时结合解剖观察后认为,红豆杉种胚本身没有休眠期,胚乳中某些抑制物的存在不利于种子的萌发,故离体培养时应当去除胚乳,然而考虑到胚乳可提供胚萌发所必需的营养物质,胚乳部分可予以保留,但必须在培养基中添加6-BA,并推测是6-BA抵消了胚乳中的抑制物的作用;赵沛基等^[38]也认为在剥离胚体时保留少量胚乳更有利于离体胚的萌发。

获得的离体胚置于无菌培养基上培养,适合的基本培养基种类较多,常用有MS、B5、White、DCR、BLCG、6,7-V和McCown等。考虑到胚在其萌发过程中会产生大量的醌类物质,通常需在培养基中添加0.3%-0.5%的AC。Liao等^[39]以曼地亚红豆杉成熟种胚为研究对象,确定最佳培养基为:1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D,pH 5.8、25℃培养30 d后,其萌发率可达62%;臧新等^[36]在考察MS、B5和BLCG对离体胚的萌发率影响后发现,培养基的种类对离体胚培养的生长与发育影响不显著;而Yang等^[40]则通过对比研究发现,B5培养基较White、MS、DCR更有利于促进南方红豆杉离体胚萌发,其诱导发芽率高达96%,且对早期胚胎出芽生长发育和诱导生根十分有利。Hoseini等^[41]对欧洲红豆杉合子胚进行离体培养,确定最适培养基组成为:MS+100 mg/L干酪素水解物+1g/L酵母浸提物+100 mg/L Vc+5 g/L AC,15 d后诱导成苗比例为20%,且发现未成熟胚和成熟胚组并无显著差异,这一结论与早期张淑华等(Chang)^[42]对台湾红豆杉研究结果类似。但与国内多数研究成果存在较大分歧,如曾余力等^{[38, 43]}对南方红豆杉、云南红豆杉离体胚展开芽诱导研究后认为,成熟胚诱导效果优于未成熟胚,且成熟已萌发胚是诱导不定芽形成的最优选择。这可能与胚的处理方式有关,国内研究发现,在剥离胚时带上少部分胚乳,其萌发率显著提高^[38],而国外研究成果中并未指明制备离体胚时需保留少量胚乳。

离体胚在25±1℃、pH 5.8、光周期12 h、光强度2 000 Lx或散光的条件下培养30 d后,即可获得正常的红豆杉幼苗。 2.2.1.3 愈伤组织诱导成苗

目前世界上主要红豆杉品种均可诱导形成愈伤组织^[44]。诱导材料常选用茎段组织而不使用叶片;基本培养基多采用MS、B5或WPM (SH)培养基,植物组培常用激素均可诱导红豆杉形成愈伤组织,但需注意生长素和分裂素浓度配比,生长素浓度控制在1.0-2.0 mg/L、分裂素浓度控制在0.1-1.0 mg/L范围内,2周左右即可诱导形成愈伤组织^{[45, 46]}。

适当提高激素用量可缩短愈伤组织形成时间,如张翔宇^[32]以改良的MS+4.0 mg/L NAA+1.3 mg/L 2,4-D+0.3 mg/L KT+0.1%活性炭为培养基,培养7 d即可形成愈伤组织,且南方红豆杉愈伤组织诱导率高达100%。

为防止褐变,需向培养基中添加抗褐化试剂,常用试剂有活性炭(AC)、水解酪蛋白(CH)、Vc等,凡利等^[47]在同时考虑愈伤组织生长速率与防止褐化的基础上,认为水解酪蛋白是最佳选择;而李丽^[48]则认为向培养基中添加0.01-0.2 mg/L Vc为最优。

获得的愈伤组织需经再分化方可诱导成苗,此时可通过减少激素用量使其生根发芽,如张翔宇^[29]即通过改良的MS+0.05 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+0.05 mg/L KT+1 mg/L CH组合培养愈伤组织,在温度25℃、湿度85%、光照1 000-1 200 Lx、光周期12 h条件下,培养60 d可诱导出芽;而Datta等^[49]通过研究喜马拉雅红豆杉的绿色愈伤组织发现,采用1/2 WPMSH+2.5 mg/L 6-BA+1% AC培养4周即可诱导出芽,1/5氮源的MS培养基培养4周即可诱导生根。

当前采用愈伤组织诱导成苗技术成果多集中在实验室阶段,且以提高红豆杉愈伤组织诱导率为主,而在提高愈伤组织生根出芽、组培苗存活率等方面研究较少。植物试管苗在培养过程中常常会出现玻璃化现象,经愈伤组织诱导的红豆杉组培苗是否也存在此问题,以及炼苗移栽过程中因生长条件的改变对幼苗的影响与对策,均有待于继续深入研究。 2.2.2 扦插

我国境内现有红豆杉品种均可进行扦插^{[18, 50]},扦插并无季节限制,但多选在春、秋季进行,以避开林木高速生长期和高温、干旱的不利气候因素^[51],也可选在夏秋高温季节进行,如南方红豆杉,采用封闭式高温扦插法^[52],其成活率可达92.7%;母树选择3-10年树龄;基质可用沙壤土、沙土、珍珠岩、园土和黏土^{[53, 54]},多选用混合土壤,且采用分层基质更有利于后期生根,提高出苗率^[55];扦插前需用1‰-3‰的KMnO₄+生根粉/IAA/NAA/IBA处理^{[56, 57, 58]};插穗多选用1-3a的木质化/半木质化枝条,以利于生根和存活,插穗长度为10-25 cm,茎粗0.3-1.0 cm,最好选用萌发枝条^[59],同时去除基部枝叶,保留顶梢和上端枝叶,下剪口斜切,剪口最好为马蹄形^[60];扦插深度保持穗长的1/3-1/2^[61],插后立即喷水,初期喷水2-3次/d,中后期保持1次/d即可;插穗后保持60%-80%遮光度,定期喷洒多菌灵/甲基托布津溶液,预防真菌侵害^[62];扦插后一般30-80 d即可生根,生根率因品种不同而异,东北红豆杉最高可达100%。 3 展望

作为解决紫杉醇药源紧缺的主要途径,实施人工造林仍是当前的不二选择,且传统培育技术相对成熟,已广泛应用至红豆杉人工育种中,并取得了良好效果。然受限于红豆杉生长缓慢、种子自然萌发时间长、生根幼苗存活率不高(1年以上)以及生长环境要求特殊等特点,单纯依靠传统培育技术仍无法有效缓解紫杉醇药源紧缺的难题,而以组培为基础的现代林业培育技术多数停留在实验室阶段,无法为红豆杉的实地种植栽培提供足够可靠的支持。但作为实现植物物种快速繁殖的最有效途径,其应用前景不言而喻。从技术层面讲,当前应主要着力于研究红豆杉种子萌发期和幼苗期营养物质与代谢成分的变化,以及基于此研究基础之上的关于外源激素与红豆杉自身调节物质之间的作用关系。详尽阐明这些机理与变化规律,是实现组培技术规模化培育人造红豆杉林的必然需求,亦是科研工作者亟需解决的技术关键。

随着研究成果的不断丰富,以及代谢调控理论、分子生物学和基因组学的深入研究,红豆杉的人工培育技术和理论将不断完善。本课题组致力于濒危物种红豆杉的近自然保护与回归关键技术研究,包括红豆杉的生态调节机制、人工反向调节以及适应不同地域气候环境红豆杉品种的培育技术,以打破气候环境因素对红豆杉生长与繁殖的限制,实现红豆杉的跨地域式培育,进一步扩大红豆杉林业种植面积。