鱼类腌制品具有悠久历史,不仅原料利用率高,货架期长,而且具有香味浓郁,咸鲜相宜的风味特点,深受广大消费者喜爱。著名的鱼类腌制品有咸黄鱼,咸带鱼,咸鲱鱼和海蜇等^[1],腌制过程有多种微生物参与,许多乳酸菌、微球菌及葡萄球菌能分泌蛋白酶、脂肪酶、氨基酸脱羧酶及硝酸盐还原酶等,蛋白酶和脂肪酶促进原料中的蛋白质分解为氨基酸和多肽,脂肪分解为短链的挥发脂肪酸和酯类物质^[2],微生物的代谢产物和原料分解产物共同形成了鱼类腌制品特有的风味。此外,一些乳酸菌、微球菌和葡萄球菌通过产酸及抗菌素等途径能有效抑制鱼类腌制品中腐败菌及病原菌的生长^[3]。但是,氨基酸脱羧酶和硝酸盐还原酶可将游离氨基酸分解为生物胺,硝酸盐转化为亚硝酸盐,过量的生物胺曾引发多起中毒事件^{[4, 5]},亚硝酸盐可以经过多种途径合成N-亚硝基化合物,N-亚硝基化合物是致癌物质^[6]。这两类物质是人们对水产品安全问题关注的热点^[7]。研究发现,乳酸菌能在鱼肉的发酵过程中抑制生物胺和亚硝酸盐的生成,并且改善腌制品的品质,缩短腌制时间。由此可见,腌制品中风味物质及有害物质的生成与微生物群落结构密切相关,但是目前对腌制品中微生物的结构和组成缺乏全面而深入的了解,因此存在诸如产品安全性差、质量不稳定、生产周期长、难以实现工业化生产等问题^[8]。本文主要对鱼类腌制品加工过程微生物群落多样性的研究现状进行阐述,并介绍最新的微生物群落多样性分析方法,为今后研究各阶段微生物种群结构组成,在鱼类腌制品品质特征形成中的作用,以及这些微生物在维持腌制品质量方面所担任的角色,如何更好地控制体系中有害微生物的生长,改善制品风味提供参考依据。 1 鱼类腌制品中微生物的分布及多样性

腌制过程中鱼肉在微生物及其产生的酶类的作用下逐渐失去原有的组织状态,肉质逐渐变软,氨基酸氮含量增加,形成鱼类腌制品特有的风味。鱼类腌制加工过程,有益微生物和有害微生物并存,了解鱼类腌制过程微生物的分布及其多样性,对于在加工过程如何促进有益微生物的生长,有效控制有害微生物的生长,保证产品的风味、品质和安全性至关重要。 1.1 传统腌制鱼中的微生物多样性

传统的鱼类腌制品主要通过自然发酵生成,发酵过程中,微生物起到了至关重要的作用,与腌制品的风味物质和食用安全性息息相关。曾令彬等^[9]研究了腊鱼加工过程中微生物的变化,结果发现,乳酸菌、微球菌、葡萄球菌和酵母菌是腊鱼加工中的优势菌群。梁慧等^[10]从传统腊鱼中分离筛选出季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)和近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)两株产香酵母,这两株菌在代谢过程中主要产生醇类和酯类,提高了腌制品的风味。陈学云等^[11]从盐干带鱼中分离得到20株葡萄球菌,其中松鼠葡萄球菌和木糖葡萄球菌可以降解蛋白质和脂肪,改善带鱼风味。Mah等^[12]还发现木糖葡萄球菌可以抑制生物胺在鱼类腌制品体内的产生。吴燕燕等^{[13, 14]}利用从传统腌制鱼中分离纯化得到的植物乳杆菌和戊糖片球菌建立了一种有效降低亚硝酸盐的方法,提高了腌制鱼的可食用安全性。并且对戊糖片球菌产亚硝酸盐还原酶的条件进行了优化,得出了在接种量4%,pH为6,培养温度为35℃,培养时间为48 h的条件下,酶活性可以提高66%的结论^[15]。曾雪峰等^[16]研究了传统湘西酸鱼中乳酸菌的多样性,结果表明在发酵的初始阶段,明串珠菌是优势菌,抑制了不耐酸好氧菌及其他微生物的生长,后来由于pH值的降低,耐酸的植物乳杆菌和戊糖片球菌成了酸鱼的主要优势菌群。综上所述,鱼类腌制品中的乳酸菌,酵母菌等微生物可改善腌制品的品质,提高可食用安全性,可以作为菌种发酵剂的来源广泛应用于食品行业中,但是,在腌制过程中还发现了Citrobacter spp.、Staphylococcu spp.和Bacillus spp.等,这些菌株能产生组氨酸脱羧酶,将组氨酸分解为组胺^[17],组胺是毒性最强的生物胺。并且有研究发现生物胺的积累与微生物种类有密切联系^[18]。 1.2 微生物发酵辅助腌制鱼中微生物多样性

乳酸菌是肉制品发酵剂中研究最早的菌种,在西式火腿^[19]、香肠^[20]、侗族酸肉^[21]和发酵鱼肉^[22]等肉制品风味形成中起着重要的作用。乳酸菌也是发酵过程中的优势微生物,并能促进发酵鱼制品的风味形成^[23]。有报道显示,将乳酸菌人工接种到发酵鱼中,可以明显改善腌制鱼的质量和风味^{[24, 25]},缩短腌制时间^[26]。当前利用的发酵剂有单一菌种发酵剂和混合发酵剂,研究表明单一菌种发酵效果不如混合菌种发酵好^[27]。所以混合菌种发酵剂将成为今后鱼类腌制品发酵剂的发展方向。王乃富等^{[28, 29]}研究了乳酸菌辅助发酵对鳙鱼肉糜菌相的影响,结果显示,鳙鱼肉糜接种乳酸菌后,细菌总数和乳酸菌数明显高于对照组,肠杆菌和假单胞菌数则显著低于对照组。谢城等^[30]利用混合菌种接种草鱼发现,实验组的大肠菌群数明显低于对照组,而且没有检出芽孢菌落。蔡敬敬等^[31]接种混合乳酸菌对鲢鱼进行发酵,结果发现在发酵初期,细菌和乳酸菌总数都逐渐增多,细菌是优势菌。发酵第5天时,乳酸菌成为了优势菌,除产生乳酸外,还形成了一些抑菌物质,有效地控制了细菌及腐败菌的生长。发酵后期,乳酸菌总数有所减少。此结果与国外研究者Yin和Saithong等^{[32, 33]}接种混合乳酸菌对鱼肉进行发酵所得到的结论基本一致。但是目前对微生物发酵辅助腌制鱼加工过程中生物胺产生菌的报道极少,筛选出产生物胺菌株,并对其生长特性进行研究,从而更好地抑制此类菌的生长,进一步提高鱼类腌制品的可食用安全性,是今后研究的重点。 2 腌制食品中微生物群落多样性研究技术

目前对腌制食品中微生物的研究主要还是应用传统的分离、纯化、鉴定方法以及进行一系列繁琐的生理生化实验,但是这种方法并不能对分离物进行精确鉴定,不能反映出分离物间的系统发育关系,无法获得微生物多样性的真正概貌^[34]。并且实验室能够培养分离出的微生物仅占总量的1%左右^[35],因此免培养的分子生物学手段,如变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)近年来被广泛地应用于发酵鱼^[36]、土壤^[37]以及水体环境^[38]中微生物群落的结构和多样性分析中。但DGGE技术也存在其缺陷,如无法检测环境中丰度较低的微生物,也难以区分相似度较高的物种^[39]。其他的分子生态学技术如限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、限制性片段多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)扩增片段长度多态性(Amplified restriction fragment polymorphism,AFLP)等,虽然结果具有直观、可视化的优点,但是操作步骤繁多,需要进行DNA多种酶切,无法全面检测出样品中大量尤其是低丰度的微生物。随着高通量测序技术的快速发展,通过对样品中微生物基因序列进行分析,可很快地确定其中微生物的种类和丰度,同时衍生出了一门新的学科--宏基因组学。1998年,Handelsman等^[40]首次提出宏基因组概念:是指在特定环境样品中基因组的总和,包含细菌基因组和真菌基因组。宏基因组学采用新一代的高通量测序技术直接对样品中微生物总DNA进行测序,不需要对微生物进行分离培养,不仅可以检测到低丰度的微生物,而且速度快,结果准确。目前已广泛应用于海洋微生物^[41],土壤微生物^[42]和病毒^[43]等方面的研究。宏基因组技术对于微生物群落的分析主要利用16S rDNA序列,有研究表明16S rDNA高变区序列得到的物种信息与全序列所得结果差异不大^[44],且高变区序列片段更短,在分析大量数据时比较可以提高效率,而且降低了成本。在腌制食品微生物群落多样性研究方面,基于16S rDNA基因V₃区的宏基因组分析已经用于天津传统食醋发酵过程微生物群落组成和多样性的研究,结果清晰地揭示了食醋这一传统发酵食品酿造过程中丰富的微生物多样性以及与代谢产物之间的联系^[45]。但应用宏基因组学技术研究鱼类腌制品中微生物群落多样性的分析却未见报道。 3 展望

鱼类腌制品是传统且大众喜爱的水产加工食品,由于传统的加工技术较落后,产品存在一些安全隐患,如何应用现代加工新技术来革新鱼类腌制品的加工技术,使其在保证传统风味的基础上,工艺先进且能实现工业化生产,产品品质保证且质量安全,已成为当前科研工作人员研究的热点。纵观已有文献报道,以往的研究主要侧重加工工艺的优化、挥发性成分及乳酸菌的功能特性,对鱼类腌制品的微生物群落多样性及其对产品品质特征形成规律的影响等缺乏研究,特别是如何运用一种有效的微生物检测方法来研究腌制体系中以乳酸菌为主的微生物群落结构及在腌制过程中的变化,阐明各阶段微生物种群结构组成以及这些微生物在维持腌制品质量方面所担任的角色,从而更好地控制体系中有害微生物的生长,改善制品风味,也为工艺优化提供理论依据。因此今后研究的重点为: 3.1 探明影响鱼类腌制品风味品质和安全性的微生物种类和分布特点

在鱼类腌制品风味研究方面,各种鱼类腌制品中挥发性成分研究已比较透彻,鱼类腌制品在后熟阶段通过微生物和酶的作用促进鱼体挥发性物质和前体转化成腌制品中的特征风味物质。但是,哪些微生物在起这个作用,这些微生物与一些腐败微生物之间的一个竞争关系,如何促进我们需要的有益微生物在整个加工过程成为优势菌,并抑制腐败微生物的生长是当前急需解决的问题。

目前,也有很多学者致力于将乳酸菌等有益菌接种到鱼体中来加速发酵的过程,那么这个过程这些有益菌的生长变化情况,以及代谢产物对产品的品质和安全性的影响也是需要了解的问题。另一方面,对鱼类腌制品中产生的亚硝基化合物、生物胺等有害物质的控制,这些有害物质的产生是哪一类微生物起主要作用及如何抑制,仍然是研究的重点。 3.2 加强宏基因组技术在微生物多样性分析中的应用研究

传统的微生物群落鉴别需要经过一系列的分离、纯化和繁琐的生理生化鉴定,时间较长,工作量大。随着微生物分析鉴定技术的发展,特别是高通量测序技术的快速发展,通过对样品中微生物基因序列进行分析,可很快地确定其中微生物的种类和丰度。但此技术也存在一些问题,如在样品DNA制备方面,目前的DNA提取方法还不能获得样品中所有未能培养微生物的全部基因组信息,这直接影响基因组文库的构建。另外,庞大的DNA序列信息也向我们提出了巨大的挑战,而生物信息学的出现则给我们带来了极大的便利,在接下来的研究中,我们需要完善宏基因组学和生物信息学的结合,进而更好地分析宏基因组文库中的巨大数据。截至今日,人们对于微生物基因资源的多样性研究还处于初步阶段,应用分子生物学技术结合传统微生物分析方法对鱼类腌制品中微生物资源进行研究势在必行。