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屈建航, 尹伊, 焦国宝, 丁长河, 张倩, 屈凌波, 刘仲敏. 2015
酸性α-淀粉酶菌株的筛选及其发酵条件研究
生物技术通报,2015,31(7): 188-192
Qu Jianhang, Yin Yi, Jiao Guobao, Ding Changhe, Zhang Qian, Qu Lingbo, Liu Zhongmin. 2015
Screening of a Strain Producing Acid-stable α-Amylase and Optimization of Its Fermentation Condition
Biotechnology Bulletin,2015,30(7): 188-192

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收稿日期:2014-11-25

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屈建航, 尹伊, 焦国宝, 丁长河, 张倩, 屈凌波, 刘仲敏. 酸性α-淀粉酶菌株的筛选及其发酵条件研究[J]. 生物技术通报, 2015, 31(7): 188-192
Qu Jianhang, Yin Yi, Jiao Guobao, Ding Changhe, Zhang Qian, Qu Lingbo, Liu Zhongmin. Screening of a Strain Producing Acid-stable α-Amylase and Optimization of Its Fermentation Condition. Biotechnology Bulletin, 2015, 31(7): 188-192
酸性α-淀粉酶菌株的筛选及其发酵条件研究
屈建航1, 尹伊1, 焦国宝2, 丁长河1, 张倩1, 屈凌波1, 刘仲敏2    
1. 河南工业大学生物工程学院,郑州 450000;
2. 河南仰韶生化工程有限公司,渑池 472400
收稿日期:2014-11-25
基金项目:国家科技支撑计划项目(2013AA102101),国家自然科学面上基金项目(31370147),河南省高校青年骨干教师资助计划(2013GGJS-077),河南省高校科技创新团队(15IRTSTHN019)
作者简介:屈建航,女,博士,研究方向:微生物学;E-mail:qjh_bata@163.com
摘要: 自淀粉厂周边土壤分离筛选到一株高效耐酸α-淀粉酶菌株SH3,初步鉴定为酵母菌,发酵粗酶pH范围3.8-8.0,最适作用pH5.0,该酶在80℃下仍有酶活,最适作用温度50℃。经单因素发酵条件的研究与优化,最适温度37℃,培养基初始pH5.0,可溶性淀粉作碳源,蛋白胨为氮源,200 mL装液量。正交试验确定最佳产酶条件为可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37℃、pH4.5,该条件下酶活力为96.8 U/mg。
关键词: 耐酸 α-淀粉酶     菌株筛选     发酵条件     工艺优化      酵母菌    
Screening of a Strain Producing Acid-stable α-Amylase and Optimization of Its Fermentation Condition
Qu Jianhang1, Yin Yi1, Jiao Guobao2, Ding Changhe1, Zhang Qian1, Qu Lingbo1, Liu Zhongmin2     
1. College of Biological Engineering, Henan University of Technology, Zhengzhou 450000;
2. Henan Yangshao Biochemical Engineering Company, Mianchi 472400
Abstract:A strain SH3 producing acid-stable α-amylase was isolated from the soil nearing a starch factory.It was preliminarily identified as yeast.The pH range of crude enzyme reaction was 3.8-8.0 with the optimum of 5.0,and the activity of the enzyme was still available in the temperature of 80℃ with the optimum of 50℃.The optimization of single-factor fermentation revealed that the optimal condition for the enzyme production was 37℃,pH 5.0,soluble starch as carbon source,peptone as nitrogen source and 200 mL liquid volume.Orthogonal test showed that the optimal fermentation condition was as soluble starch of 15 g/L,peptone of 30 g/L,37℃ and pH4.5,under which the enzyme activity was 96.8 U/mg.
Key words: acid-stable α-amylase      strain screening     fermentation condition     process optimization      yeast    

α-淀粉酶可从淀粉分子内部切开α-1,4 糖苷键,生成糊精和还原糖,广泛应用于食品、酿造、制药、纺织及石油开采等诸多领域,在工业生产中有极其重要的地位,是目前用途较广泛的一种酶制剂[1, 2]。目前工业应用的α-淀粉酶主要来源于细菌和丝状真菌[3, 4],在原始菌株中,真菌来源的α-淀粉酶被发现比细菌更稳定[5]。国外对酸性α-淀粉酶的研究起步较早,1963年日本Yasuji等[6]发现可用真菌生产酸性α-淀粉酶。在酵母菌中也发现了部分能产生高酶活α-淀粉酶的菌株[7]。我国对产α-淀粉酶菌株的研究起步较晚,尤其是耐酸性α-淀粉酶。目前,国际上一些大的酶制剂公司生产耐酸α-淀粉酶的菌种50%是基因工程菌[8]。近年来,已发现数十株优良产α-淀粉酶菌,包括耶鲁维亚酵母(Yarrowia)、类酵母(Aureobasidium)、毕赤氏酵母(Pichia)、假丝酵母(Candida)、红酵母(Rhotolorula)等[9],对酵母菌应用于工业生产α-淀粉酶有了进一步推动[10]。本研究筛选出一株耐酸性α-淀粉酶酵母菌株,研究且优化其发酵条件,旨在为工业利用提供参考。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 土壤样品

河南省偃师某面粉厂污水排出口处采集土壤样品。4℃保存备用。 1.1.2 培养基

筛选培养基(g/L)[1]:牛肉膏 3,蛋白胨 10,NaCl 5,可溶性淀粉 10,琼脂粉 15,pH 5.0。种子及发酵培养基(g/L)[11]:胰蛋白胨5,可溶性淀粉10,(NH4)2SO4 2.5,KH2PO4 3,CaCl2 0.2,pH调至5.0。 1.2 方法 1.2.1 酸性α-淀粉酶产生菌的分离筛选

初筛:土壤样品,10倍梯度稀释法涂布于筛选培养基,28℃恒温培养。滴加碘液,记录有透明圈的菌株。复筛:将初筛有透明圈的菌株,接种种子培养基,37℃、200 r/min培养12 h,以10%的接种量转至发酵培养基,相同条件培养24 h。发酵液5 000 r/min离心15 min,上清为粗酶液,测定酶活[1]。 1.2.2 淀粉酶活力测定方法

Yoo酶活测定法[12, 13]稍加改进:2.5 mL 0.5%可溶性淀粉溶液与2.5 mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH5.0)50℃恒温水浴锅预热10 min,加入酶液0.5 mL,50℃下准确反应10 min,加入5 mL 0.1 mol/L的盐酸终止反应,取上述混合液0.5 mL与5 mL碘液混匀,660 nm测定吸光度值R(以2.5 mL蒸馏水代替可溶性淀粉溶液,其余条件相同作为空白)。在上述反应条件下,以0.5 mL的缓冲液代替0.5 mL酶液,测定吸光度值R0[11]。

酶活定义:50℃、pH5.0条件下,10 min水解1 mg淀粉所需的酶量为一个酶活力单位。

酶活公式:待测酶活(U/mg)=100*D*(R0-R)/R

其中,D:稀释倍数,R0:对照吸光值,R:酶液的吸光值,100:转换系数。 1.2.3 菌种ITS序列鉴定 1.2.3.1 分子试剂及引物

Taq mix(TaKaRa)、ITS4引物5′-3′:ggAAgTAAAAgTCgTAACAAgg、ITS5引物5′-3′:TCCTCCgCTTATTgATATgC。 1.2.3.2 基因系统发育鉴定

基因组总DNA的提取参考文献[14]进行。ITS序列PCR扩增反应体系:Taq mix 12.5 μL,ITS4 0.5 μL,ITS5 0.5 μL,ddH2O 9 μL,基因组DNA模板2.5 μL,总体积25 μL。反应过程:95℃ 5 min,30次循环(94℃ 30 s,55℃ 1 min,72℃ 1 min),72℃ 10 min。PCR产物测定核苷酸序列,GenBank数据库完成BLAST比对。 1.2.4 酶学性质研究

37℃、200 r/min培养48 h的发酵液上清作为粗酶,pH3.8、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0的缓冲条件,分别测定酶活以确定pH范围。设置30、37、45、50、55、60、70和80℃温度条件测定酶活以确定温度耐受性。 1.2.5 产酶发酵条件研究 1.2.5.1 菌株产酶曲线

种子液10 mL接种到100 mL发酵培养基,从3 h开始每小时测定酶活,以培养时间为横坐标,酶活力为纵坐标绘制产酶曲线。 1.2.5.2 温度对菌株产酶的影响

以5%的接种量将种子液接至100 mL发酵培养基,分别28、37、40℃振荡培养,从产酶高峰期开始每小时测定酶活。 1.2.5.3 初始pH对菌株产酶的影响

调节发酵培养基初始pH值为4.5、5.0、5.5、6.0,接入5%种子液,37℃、200 r/min培养,在产酶高峰期取样,测定酶活。 1.2.5.4 碳源对菌株产酶的影响

分别以0.5%葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作为碳源,5%的接种量至100 mL发酵培养基中,37℃、200 r/min培养,在产酶高峰期测定酶活[15]。 1.2.5.5 氮源对菌株产酶的影响

分别以0.5%蛋白胨、棉籽饼、黄豆饼、牛肉膏作为氮源,5%的接种量至100 mL发酵培养基中,37℃、200 r/min培养,在产酶高峰期测定酶活。 1.2.5.6 装液量对菌株产酶的影响

在500 mL三角瓶中分别装入50、100、150、200 mL发酵培养基,接入5%的种子液,37℃、200 r/min培养,在产酶高峰期测定酶活。 1.2.6 正交试验

根据单因素优化实验结果,针对碳源、氮源、温度和pH,经SPSS软件设计四因素三水平正交实验[16]。 2 结果 2.1 菌株筛选

共筛选出产酸性α-淀粉酶的菌株24株,部分筛选结果见表 1,其中初筛SH3菌株,透明圈/菌落直径比最大,D/d为5,选其作为实验菌株。

表 1 菌种初筛结果
表选项
2.2 菌种鉴定

PCR扩增菌株18S ITS基因片段,测序后GenBank序列比对,结果与红酵母属(Rhodotorula sp.)的序列同源性最高,为97%(AM901697)-98%(NR073315),基本确定为酵母菌。 2.3 产酶曲线

产酶曲线见图 1,由图 1可见酶活先上升后下降,在14 h酶活达到91.4 U/mg,此后酶活迅速下降,12-15 h是高酶活时期。

图 1 SH3 菌株产酶曲线图
图选项
2.4 酶的pH和温度范围

50℃、不同pH下测定菌株SH3的α-淀粉酶活力,结果如表 2所示。SH3所产淀粉酶活力受酸碱度影响较大,该酶在pH3.8-8.0之间均有酶活,在偏酸性条件下酶活力较高,pH5.0为酶反应最适pH,酶活为79.8 U/mg。

表 2 酶的 pH 耐受范围
表选项

pH5.0、不同温度下测定SH3酶活力,结果由表 3可知,该酶在30℃-80℃均有酶活,30℃-50℃酶活力随温度升高而升高,最适作用温度为50℃,酶活力为74.2 U/mg。

表 3 酶的温度作用范围
表选项
2.5 产酶发酵条件优化结果 2.5.1 温度对菌株产酶的影响

28℃、37℃、40℃发酵条件下研究温度对菌株SH3产酶的影响,结果(图 2)表明,37℃和40℃酶活均是先上升后下降,37℃酶活14 h达到最高91.6 U/mg,40℃酶活与37℃相比上升较快,13 h达到最高91.3 U/mg,但下降也较快。28℃菌体生长缓慢,高活性酶活出现较晚。可能随温度升高生长代谢加快,产酶高峰期提前。选取37℃作为最佳发酵温度。

图 2 温度对产酶的影响
图选项
2.5.2 装液量对菌株产酶的影响

由图 3可知,在发酵高峰期,相同时间内200 mL装液量的发酵酶活最高,14 h时达到最高88.2 U/mg。

图 3 装液量对菌株产酶影响
图选项
2.5.3 初始pH对菌株产酶的影响

选取pH4.5、5.0、5.5、6.0的初始培养条件,分别测定SH3酶活力,结果(图 4)表明,pH4.5-6.0条件下菌体均能生长,发酵14 h时测定酶活,pH5.0发酵条件下酶活最高,为89.7 U/mg,依次高于pH5.5、6.0和4.5,其中pH4.5发酵条件下酶活相对最低,为33.4 U/mg。

图 4 初始培养基 pH 条件对产酶的影响
图选项
2.5.4 碳源和氮源对菌株产酶的影响

由表 4可知,可溶性淀粉作为培养基碳源时酶活最高,为87.95 U/mg,葡萄糖作碳源时酶活最低。而氮源中蛋白胨为最佳氮源,酶活最高达到93.39 U/mg,棉籽饼作氮源时酶活最低,为53.82 U/mg。

表 4 碳源和氮源对菌株产酶的影响
表选项
2.6 正交实验及结果

在单因素的基础上,对可溶性淀粉、蛋白胨、初始温度与pH四因素作三水平正交试验(表 5)。由表 6可知,最佳发酵条件为可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37℃、pH4.5,对应酶活最高为96.8 U/mg。极差分析结果可看出,碳源对菌株产酶的影响最大,影响程度依次为:可溶性淀粉>蛋白胨>pH>温度。

表 5 四因素三水平表
表选项
表 6 正交实验结果及极差分析结果
表选项
3 讨论

酶α-淀粉酶是基于淀粉糖原料生产产品过程中使用的主要糖酶,在全球酶制剂产业中占30%左右[17, 18]。传统α-淀粉酶最适作用pH值为5.8-6.2,而淀粉乳偏酸性(pH3.2-4.5),进一步糖化也是在酸性条件(pH4.2-4.5)下进行,即液化前后需两次调pH,影响产品提取,不利于节能减排。耐酸耐高温α-淀粉酶可有效解决这一问题,需求量越来越大,已在欧美等发达国家得到广泛应用,但菌种选育等核心技术也被国外跨国公司所垄断。我国缺乏高产菌株,尚不能自主生产。

现阶段筛选得到的产酸性α-淀粉酶菌株主要是芽孢杆菌和曲霉[20, 21, 22],普遍存在产酶水平较低的问题,仍需在自然界筛选高酶活菌株,并进一步优化耐酸、耐高温性能。采用基因工程技术对功能基因进行定向改造,构建工程菌,是选育高产、高性能菌株的重要途径[19]。 4 结论

从土壤样品中分离到一株产酸性α-淀粉酶菌株SH3,该菌18S ITS序列与红酵母菌相似性97%。其酶活性最适作用pH5.0,最适作用温度50℃。最佳发酵条件为可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37℃、pH4.5,对应酶活力96.8 U/mg。

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