曲霉属(Aspergillus)真菌含有约300个种,是广泛分布于各种气候条件下的一类常见的丝状真菌^[1]。曲霉多易生长在营养丰富的环境中,含淀粉丰富的食物尤其适合曲霉的生长^[2]。其中黄曲霉(A.flavus)和米曲霉(A.oryzae)是最为人们所熟知的两个曲霉,前者因产生强烈致癌物质黄曲霉素而成为食品安全的重要威胁,后者则在食品酿造工业和酶工业中发挥着的不可替代的作用^[2]。米曲霉在我国及日本、韩国应用于酒类、酱油及食醋的酿造已经有超过2 000年的历史了。已经发现米曲霉的代谢物具有抗真菌^[3]、细胞毒^[4]等活性。但尚未见有关其代谢物诱导植物抗性的报道。

氧爆发(Oxidative burst)是植物免疫反应中重要的早期事件^{[5, 6, 7]}。植物细胞在遇到病原菌侵害、机械力损伤等情况下会快速地产生活性氧(Reactive oxygen species,ROS)。ROS可以增强细胞壁交联,激活防御相关的基因,并合成抗菌蛋白和植物抗毒素,乃至最终诱导细胞程序死亡^[8]。在氧爆发过程中,植物细胞壁通过加强质膜结合的NADPH氧化酶、细胞壁结合的过氧化物酶和质外体中的氨氧化酶的活力,提高ROS的产量^{[9, 10]}。此外,H₂O₂也可能发挥信号转导作用而激活水杨酸信号通路,通过水杨酸的积累,激活特异防御途径,最终使植物体建立获得性抗性^[11]。因此可以通过激发植物自身的抗性这一途径来实现对病虫害的合理防控。由于激活植物抗性的激活剂作用于植物本身,毒性为这类新型农药的非必要特性,因此具有更佳的安全性。

本研究通过诱导氧爆发这一细胞反应特征来发现具有潜在的诱导植物抗性反应的先导化合物。以分离自大连凌水桥附近海域潮间带繁茂膜海绵(Hymeniacidon perleve)的50株真菌为受试菌株,通过测试激活烟草植物细胞产生活性氧水平来筛选目标菌株,并对这一菌株进行菌种鉴定。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株

繁茂膜海绵(Hymeniacidon perleve)样品采集自渤海湾大连淩水桥海域的潮间带,从中分离得到50株真菌。所有菌株保藏于中国科学院沈阳应用生态研究所农业微生物组。1.1.2 培养基

马丁培养基(酵母膏0.5 g,葡萄糖1.0 g,蛋白胨0.5 g,海盐2.5 g,蒸馏水100 mL,pH7.0-7.2),用于菌株活化。察氏培养基(硝酸钠0.3 g,磷酸氢二钾0.1 g,硫酸镁0.05 g,氯化钾0.05 g,硫酸亚铁0.001 g,蔗糖3.0 g,琼脂2.3 g,蒸馏水100 mL)用于菌株的保存及鉴定。马铃薯-葡萄糖培养基(20%土豆浸出液100 mL,葡萄糖2 g,pH7.0-7.2),用于液态发酵时种子液的培养。1.1.3 烟草细胞

烟草(Nicotiana tabacum)细胞用固态MS培养基(Murashige and Skoog medium)进行常规培养和继代。细胞悬浮培养采用pH5.75不含琼脂的MS培养基在恒温25℃条件下摇瓶(110 r/min)暗培养。每周转接4 mL细胞悬液至100 mL新鲜培养基中进行培养。检测用细胞采用处于对数生长期(培养6-10 d)的烟草悬浮细胞。1.1.4 试剂与溶液

蛋白酶K溶液:50 mmol/L TrisHCl,pH7.5,10 mmol/L CaCl₂,终浓度为20 mg/mL的蛋白酶K。TE缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA,pH8.0。1%琼脂糖凝胶电泳试剂:琼脂糖0.2 g,TAE缓冲液(pH7.6,4 mol/L Tris-HCl 2.5 mL加0.05 mol/L EDTA 5 mL,定容至250 mL)20 mL,核酸染料2 μL。1.2 方法1.2.1菌株粗代谢产物的制备

将50株真菌分别接种于液态发酵培养基中。每500 mL三角瓶装100 mL液体培养基,并接种3块直径10 mm的长满菌丝的固体培养基。28℃、180 r/min条件下振荡培养8 d。发酵结束后,向过滤后的发酵液中加入3 g大孔吸附树脂,110 r/min振荡2 h。抽滤得树脂,先用纯水洗树脂2次,再用甲醇解吸附3次。甲醇溶液减压浓缩并冷冻干燥得粗代谢产物。1.2.2 激活氧爆发活性筛选^{[12, 13]}

烟草悬浮细胞在25℃、110 r/min、暗条件下培养8 d。向细胞培养液中加入溶解于DMSO中的H₂DCF-DA,使得其终浓度为10 μmol/L,在28℃暗条件下孵育30 min。检测时取的细胞悬浮液于96孔板中(150 μL/孔),以水杨酸为阳性对照(SA,400 μmol/L)。加入50 μL浓度为1 mg/mL试验样品进行处理。应用荧光酶标仪Synergy HT检测H₂O₂产量,激发波长为485 nm,发射波长为528 nm。各处理重复3次。1.2.3 菌株的培养特征和显微形态观察

培养特征:将菌株接种于查氏培养基上,28℃培养4-10 d,并记录菌株的菌落颜色、边缘、质地及色素产生情况等特征。形态特征:采用插片培养法28℃培养4 d后,在光学显微镜下观察菌株的菌丝形态及产孢结构,在电子显微镜下观察分生孢子的形态特征。1.2.4 菌株的生理生化特征

氢醌染色实验:用10 mg/mL的氢醌溶液喷于菌落上,继续培养1-2 d,观察菌落边缘的颜色。茴香醛染色实验:用含0.05%的茴香醛的查氏培养基斜面30℃培养菌株一个月,观察孢子是否变为粉色。大米褐变实验:将10 g米饭置于100 mL的锥形瓶中,接种菌株并在34℃培养40 h。加入50 mL蒸馏水并过滤。室温放置,观察大米褐变情况。黄曲霉素产生情况:用大米作为培养基培养菌株。用MeOH-H₂O (55:45,V/V)超声提取30 min,提取液用正己烷萃取2次,下层继续用CH₂Cl₂萃取。CH₂Cl₂层回收溶剂后用丙酮-CH₂Cl₂(3:7,V/V)进行TLC (GF₂₅₄)展板,在365 nm下观察荧光斑点。1.2.5 分子生物学鉴定

菌株HMP-F66摇床培养2 d后收集菌体,利用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取HMP-F66的DNA。50 μL PCR扩增反应体系中包括10×PCR buffer 5 μL,dNTP 4 μL,ITS1和ITS4引物各1 μL,Taq酶0.5 μL,模板1 μL,最后加重蒸水补足至50 μL。以ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')为引物,扩增菌株的rDNA ITS (Internal Transcribed Spacer)序列。扩增反应程序为:95℃预变性5 min;95℃变性30 s;56℃退火40 s;72℃延伸1 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,委托生工生物工程(上海)有限公司进行纯化和序列测定。序列通过BLAST进行同源性比对后,利用MEGA 6.06进行多序列比对,最终用Maximum likelihood法构建系统发育树。2 结果2.1 筛选结果

活性筛选结果(图 1)表明,在当前测试浓度下菌株HMP-F66在100 min内能够诱导烟草细胞持续性地产生过氧化氢。其诱导烟草细胞氧爆发的活性极显著地(P<0.01)高于阳性对照水杨酸(400 μmol/L)的活性,说明HMP-F66的代谢物能够显著地诱导烟草细胞产生氧爆发反应。

图 1 菌株 HMP-F66 的粗代谢物诱导烟草悬浮细胞持续性产生过氧化氢(RHP:H2O2 相对产量)

图选项

如图 2所示,HMP-F66生长迅速,菌落最初呈白色,逐渐变为黄色或者黄色稍含浅绿色,随培养时间的延长绿色逐渐加深,但仍以黄色为主;边缘呈白色,整齐;中心圆形区域微隆起;质地疏松;无渗出物;背面黄棕色,培养约7 d后出现近圆形(还可见同心圆伴随辐射状)褶皱;无菌核产生。光学显微镜下可见菌丝有隔膜,为多细胞霉菌。菌丝体产生大量分生孢子梗,孢子梗很长,表面粗糙。分生孢子梗顶端膨大成烧瓶状顶囊,分生孢子头可见球形放射状和类扫帚状两种。顶端着生成串的球形分生孢子,分生孢子呈黄棕色。在电子显微镜下可见分生孢子呈球形或者近球形,直径约4.0 μm,表面粗糙,具褶皱状纹理,无小刺。

图 2 HMP-F66 菌落形态和显微形态

图选项

氢醌染色实验:喷洒氢醌溶液的菌落的边缘呈现红褐色;茴香醛染色实验中,培养1个月的菌株未出现粉色孢子的产生;大米培养基在褐变实验中逐渐变黄;在TLC薄层板上未观察到黄曲霉素特征性荧光斑点。2.4 分子生物学鉴定

将菌株HMP-F66的DNA经PCR扩增后进行测序,得到长度为525 bp的序列,将该序列(GenBank登录号KP171697)与GenBank核酸序列库的相关菌株进行相似性比对,选取12株同源性高的模式菌株,利用MEGA6.06软件构建系统发育树,结果如图 3所示,菌株HMP-F66与菌株Aspergillus oryzae TUHT 114以及Aspergillus flavus TUHT189在系统发育树上处于同一分支,同源性达100%。

图 3 真菌 HMP-F66 基于 rDNA ITS 的系统发育树

图选项

HMP-F66的菌落特征、显微形态、特征生化反应等均表明该菌株应为与黄曲霉类似的曲霉菌,进一步的分子生物学鉴定结果表明该菌株为米曲霉或者黄曲霉。米曲霉和黄曲霉的形态学特征及培养特征非常相似,但一般来说,米曲霉通常具有较长的分生孢子梗,而黄曲霉的孢子梗通常较短^{[14, 15]}。米曲霉的分生孢子颜色为黄色或者棕黄色(Strawcolored),而黄曲霉的分生孢子颜色则通常为绿色^[16]。与米曲霉相比,黄曲霉更容易形成菌核^[15]。此外,孢子不能在含茴香醛的培养基上变为粉色也常作为区分曲霉的依据^{[14, 15]},但这一判断方法的可靠性并没有得到验证。米曲霉作为食品发酵用菌株具有长期的安全应用历史,因此是否产生黄曲霉素也是判别二者的依据^[15]。综上,HMP-F66具有较长的分生孢子梗、分生孢子呈棕黄色、不产生菌核、TLC检测未见黄曲霉素特征性荧光斑点,这些特征更支持该菌株为米曲霉而非黄曲霉。因此,我们推测HMP-F66为米曲霉(A.oryzae)。3 讨论

米曲霉和黄曲霉均属于曲霉属环绕亚属(Circumdati)黄绿组(Flavi),前者不产生黄曲霉素,在东亚国家的食品发酵中具有较长的应用历史。研究表明,米曲霉应是在长期的食品发酵过程中通过水平基因转移,从黄曲霉的一个类群(Group I)进化/驯化而来^{[17, 18]},因此二者在分类学上的关系非常接近,它们具有近乎一致的DNA/DNA杂交,其形态学差别也很微小。实际上,近年来的全基因组研究更支持将米曲霉和黄曲霉归属于同一个种而非两个独立的种^{[17, 19, 20]}。因此,目前对于二者的区分更多地依赖于形态学和培养特征等鉴别手段而不是其遗传学特征^{[21, 22]}。Murakami^[15]通过对406株曲霉的形态学特征、培养特征以及生理生化反应等多个指标进行基于主成分分析后归纳出了不同曲霉的分类学判定方法。Christensen^[16]依据顶囊、孢子头、孢子梗、孢子及菌核形态给出了黄曲霉类真菌的检索表。虽然如此,黄曲霉和米曲霉的形态学和培养特征仍然具有很大重叠性^{[15, 16]}。需要指出的是,虽然现有的证据更支持HMP-F66为米曲霉,但我们对于该菌株的鉴别仍有不足的地方:首先,菌核的产生与否会受到培养条件的影响,实际上菌核本身的形态更具有判别价值^[16]。由于我们尚未观察到HMP-F66产生的菌核,因此无法根据这个特征来判别。其次,Murakami^[15]认为单层或者双层产孢结构与分生孢子的尺寸之间的关系可以在一定程度上区别黄曲霉和米曲霉,但受限于目前的条件,我们未能区分该菌株是单层或者双层产孢结构。此外,黄曲霉素的产生与否是判别米曲霉的必要但非充分条件,我们认为采用基于LC-MS等更加精确的手段检测黄曲霉素也可作为辅助性的判别方法。

米曲霉是重要食品发酵工业和酶工业生产菌株。我们在前期研究中发现米曲霉可以合成新型环匹阿尼酸(cyclopiazonic acid,CPA)类化合物,这种化合物对植物根系的生长具显著的影响^[23]。因此推测,该化合物可能因为其与生长素(IAA)相似的结构母核而成为IAA的类似物,竞争性地拮抗IAA与受体的结合,从而抑制IAA的作用。又因为IAA可降低植物抗病性^[24],而阻滞IAA则可以提高植物的抗病性^{[25, 26]},因此认为CPA类化合物是潜在的植物抗性诱导剂。HMP-F66表现出了显著的诱导烟草细胞产生氧爆发的活性,这可能与米曲霉基因组中的CPA合成基因表达合成CPA有关。因此,尚需进一步阐明该菌株诱导氧爆发活性的代谢产物是否与CPA的合成有关。4 结论

从50株繁茂膜海绵共附生真菌中筛选出一株可显著诱导烟草悬浮细胞产生氧爆发的菌株。通过形态学特征、培养特征、生理生化特征性反应、分子生物学等方法推测菌株为米曲霉(A.oryzae)。